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《清华大学》 2010年
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用于精子筛选及体外受精的微流控芯片的构建及应用

谢兰  
【摘要】:过去三十年来,体外受精技术被广泛应用于解决人类不孕不育问题。在获得实践成功与技术突破的同时,该领域仍有一些问题亟待解决,包括:目前临床上使用上游法来挑选有活力的精子进行后续操作,而忽略了化学趋向性、温度趋向性等其他衡量精子健康的重要指标;体外受精的环境以及胚胎培养的条件与体内相差甚远,且人工操作的复杂性可能对胚胎产生不利的影响。微流控芯片技术为解决这些问题提供了新的解决思路和途径,我们的工作主要是通过构建不同的微流控芯片,来解决三个方面的问题:1)优化了用以筛选精子活力的直管道的长度、宽度、深度以及筛选时间,通过对不同尺寸管道出口池的精子活力与精子相对数量两项指标进行比较,我们发现长7 mm、宽1 mm、深100μm的管道对小鼠精子具有最好的活力筛选效果,最优的筛选时间在15-30 min之间。2)设计并制作了一款微器件,使用直管道连接双分叉管道来模拟女性生殖道,用以同时筛选精子的活力和化学趋向反应。通过有选择性地将卵丘细胞种植在双分叉管道的其中一侧来形成化学梯度,用游向不同分叉管道的精子数量比例来表征精子的化学趋向性。我们的试验证实约有10%的小鼠精子具有化学趋向能力,这一比例和以往的研究相一致。3)设计和制作了一款体外受精微器件,可以将精子活力筛选、卵细胞定位、体外受精、换液、早期胚胎培养、胚胎追踪和原位染色等各个方面集成起来。我们利用4×4的八柱定位单元来定位小鼠卵细胞,四条以卵细胞定位区域对称分布的直管道来实现精子活力筛选与快速换液。每个受精卵的受精和发育情况可以通过显微镜进行实时追踪和原位荧光染色观察。通过四管道筛选以后的小鼠精子活力由60.8±3.4%提高到96.1±1.9%,通过和常规80μl微液滴体外受精组对比,我们发现两组的胚胎生长速度和囊胚形成率类似(p0.1)。 总之,本工作所构建的精子活力和化学趋向性筛选芯片可以同时对精子的活力与化学趋向反应能力进行评估,筛选出的健康精子可以很容易被整合到未来的“体外受精-芯片实验室”上;构建的体外受精芯片则为人类体外受精和动物胚胎制备提供了一个集成的平台,可以减少手工操作造成的对细胞的不利影响。
【学位授予单位】:清华大学
【学位级别】:博士
【学位授予年份】:2010
【分类号】:R714.8

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