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《清华大学》 2003年
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基因工程菌的构建及制备7-氨基头孢烷酸的研究

罗晖  
【摘要】:7-氨基头孢烷酸(7-ACA)是生产头孢菌素的重要原料,目前都由头孢菌素C通过化学法或生物酶法生产。与化学法相比,酶法裂解可以使生产过程简化,达到产品的高收率和高质量,同时减少污染。但是在目前的酶法生产中,酶活还比较低,生产成本还比较高。为此,本论文从基因工程技术和生物信息学分析入手,成功构建了产D-氨基酸氧化酶(DAAO)和戊二酰基-7-氨基头孢烷酸(GL-7-ACA)酰化酶的高酶活重组菌,并在此基础上进一步发展了酶催化制备7-ACA的新工艺。主要的工作如下: 通过反转录-PCR的方法从三角酵母中得到DAAO基因,将其克隆到大肠杆菌的表达质粒pET-28上,经转化和筛选得到重组菌BL21(DE3)/ pET-DAAO,并对其诱导表达条件进行了优化。通过补料分批培养及乳糖的诱导,得到DAAO最高酶活为175U/mL,为同类文献报道中的最高值。对DAAO在毕赤酵母中的克隆和表达进行了初步研究,但两株毕赤酵母重组菌株(胞内表达型和分泌表达型)均只能表达出很低的酶活。 提出了一条快速获取GL-7-ACA酰化酶基因的新方法。先经过微生物选择性培养,使得土壤中的假单胞菌得到富集,同时去除了土壤中绝大多数对PCR扩增有抑制作用的有机物。从土壤的选择性培养液中提取微生物的DNA,通过PCR的方法直接扩增成功得到GL-7-ACA酰化酶基因。该法操作简单、快速,与传统方法相比具有极大的优势。 为获得高酶活表达,将GL-7-ACA酰化酶基因通过PCR突变的方法去除其信号肽序列,并将其连接到质粒pET-28a上,构建的重组大肠杆菌BL21(DE3)/ pET-ACY能够表达出GL-7-ACA酰化酶活性。通过补料分批培养及诱导表达条件的优化,得到GL-7-ACA酰化酶最高酶活为3000U/L。与文献相比,属于较高的水平。进一步将GL-7-ACA酰化酶基因在毕赤酵母中进行了克隆和表达。经甲醇诱导,胞内表达型菌株GS115(pPIC 3.5k-ACY)的最高酶活为75 U/L;分泌表达型菌株GS115(pPIC9k-ACY)胞内表达的酶活最高为101 U/L,胞外分泌的酶活约为40 U/L,均大大低于在大肠杆菌中的表达水平。 采用亚克隆的方法构建得到了DAAO和GL-7-ACA酰化酶基因共表达的重组大肠杆菌BL21(DE3)/ pET-DA。对重组菌进行补料分批培养,最高DAAO WP=4 酶活约为95U/mL,最高GL-7-ACA酰化酶酶活约为390U/L。尽管其酶活不及酶单独表达时的活性,但表明用基因共表达重组大肠杆菌同时产双酶直接催化头孢菌素C生产7-ACA的思路是可行的。 首次提出构建DAAO和GL-7-ACA酰化酶的融合蛋白的构想。分别构建得到融合蛋白DLA和ALD的基因重组质粒pET-DLA和pET-ALD。融合蛋白DLA在表达时不能正确折叠,没有GL-7-ACA酰化酶的活性,但是具有DAAO的活性。融合蛋白ALD在重组大肠杆菌的表达产物保留了GL-7-ACA酰化酶和DAAO的活性,并能用于头孢菌素C直接催化生产7-ACA,使得基因工程菌的培养表达、酶的分离纯化及头孢菌素C的催化工艺都得到简化。对融合蛋白ALD基因重组菌的表达条件进行了研究,并讨论了融合蛋白在大肠杆菌中的表达机制。 提出一条新的用游离细胞反应与膜分离耦合生产7-ACA的工艺:用游离细胞进行催化,用中空纤维膜将反应体系中的细胞和催化产物—7-ACA进行分离。结果表明,细胞与反应液可完全分离,过滤液澄清透亮,产物7-ACA可全部通过膜,没有损失,分离得到的细胞可重复使用,经膜法分离制备的7-ACA纯度为93.1%,优于离心分离法。使用该工艺,可以省去酶的提取、纯化、固定化等操作,简化了工艺,并能降低7-ACA的生产成本。 本论文的创新性研究成果为进一步研究提高重组菌的酶活和将自我开发的重组菌及新工艺用于酶法生产7-ACA打下了坚实的基础。
【学位授予单位】:清华大学
【学位级别】:博士
【学位授予年份】:2003
【分类号】:TQ463

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