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磷酸原激酶的结构与功能研究

郭淑元  
【摘要】:本文首次对兔肌肌酸激酶(CK)进行了N末端2-7位氨基酸的缺失研究,系统地比较了缺失突变体与野生型在结构和功能上的区别。在结构的稳定性方面,借助于CD光谱、荧光光谱、凝胶过滤层析、脲梯度电泳以及差示扫描量热(DSC)等实验手段,深入研究了二者在二级结构、三级结构、四级结构等不同结构层次上所发生的变化,比较了二者在变性剂中的稳定性以及热稳定性上的差别。并且通过比活、米氏常数等的测定,比较了缺失突变体与野生型在催化功能以及与底物结合能力上的差异,确定了兔肌CK N末端的2-7位氨基酸残基并不参与二聚体形成,但是在维持酶的正常结构中,尤其是在维持正常的活性区构象中起到一定作用。 本文首次成功构建了海参精氨酸激酶(AK)的原核表达重组质粒,并在E.coli中获得了大量的可溶性表达。摸索出了该酶纯化的条件,并且获得了非融合蛋白的纯品,从每升培养物中可以获得83 mg的AK。并对AK的基本物理性质和二级结构进行了分析。 本文还首次对海参AK进行了去折叠的研究,探讨了此酶在脲溶液中的去折叠路径,并且在低浓度的脲溶液中捕捉到了有活性的中间体,光谱学数据和凝胶过滤层析结果表明此中间体在二级结构、三级结构以及四级结构上与天然态AK有许多相似之处,因此本研究认为此中间体为“高度有序的熔球态中间体”。 另外,为了揭示海参精氨酸激酶的催化机理,探讨它与单亚基精氨酸激酶及肌酸激酶催化机理的异同,本文首次对该酶进行了结晶和初步的晶体学研究,获得了精氨酸激酶复合物晶体,X-射线衍射结果表明衍射点的形状接近圆形,边缘比较锐利,收敛得很好,而且整个晶体的单晶性也很好。对获得的X-射线衍射图样进行了初步处理,计算出了晶胞参数等数据,并确定了空间群。


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