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点突变研究海参精氨酸激酶的活性位点

王政  
【摘要】:本文研究的是海参Stichopus japonicus精氨酸激酶Arginine Kinase(ATP: arginine N-phosphotransferase, EC 2.7.3.3,简称AK),它是一种磷酸原激酶,由两个分子量为42 kD的相同亚基构成,等电点为8.05。 本文使用点突变的方法得到了海参精氨酸激酶的三种突变体:Cys274Ala(C274A)、Arg283Gly(R283G)和His287Ala(H287A),并通过E.coli进行了表达。大部分AK都以包涵体的形式存在。经过纯化之后对三种突变体的催化活性和一些结构特征进行了分析。三种突变体和野生型相比二级结构几乎没有发生变化,但是催化活性却几乎完全丧失。ANS荧光光谱显示突变体R283G和H287A的疏水表面相对于野生型大大降低,而突变体C274A则和野生型基本没有差别。分子筛层析(SEC)显示三种突变体和野生型之间的差别都极小,突变体C274A比野生型的分子结构略微紧凑些,而突变体R283G和H287A的结构则略微松散些。Native-PAGE结果显示突变体C274A的正电荷增加了,而突变体R283G和H287A的负电荷增加了。这些结果表明这三个位点在结构或者功能的保持方面有着重要作用。 曾经有报道证明兔肌肌酸激酶的Cys283是活性位点,而这个Cys残基正好是各种肌酸激酶和精氨酸激酶在进化中高度保守的位点,在海参精氨酸激酶中即是Cys274。还有人曾经用OPTA修饰海参精氨酸激酶的Cys残基,证明每个亚基中只有1个Cys是活性必需的氨基酸。在解出的单亚基鲎精氨酸激酶的晶体结构中,有人指出鲎AK序列中的Cys271残基在底物精氨酸与酶的结合中发挥作用。对比鲎AK和海参AK的序列可以得知,海参AK序列中的Cys274,其功能与鲎中Cys271应该类似。因此海参精氨酸激酶中的Cys274残基,很有可能是它的活性位点。


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