海参精氨酸激酶的反应半胱氨酸巯基的初步研究

【摘要】：本文用DTNB的化学修饰及DTT的激活底物反应动力学对海参肌肉中双亚基精氨酸激酶(AK:N-精氨酸磷酸转移酶EC2.7.3.3)中半胱氨酸巯基在催化过程中所起的作用进行了初步研究。 首先成功地构建了带有His-Tag的突变体AK-C274AH,获得大量的可溶性表达,经镍柱纯化,得到纯度达99%的蛋白。每升培养物可获得150 mg以上蛋白,且其蛋白性质相对没有变化,解决了突变体纯化的难题。 由NR/R单向电泳得知,海参双亚基AK与CK不同,它不存在二硫键,它的10个半胱氨酸均为-SH形式。说明双亚基分子中的半胱氨酸的-SH在酶的三级结构中也相距较远,或者相距较近但它们的方向不对,故不能形成二硫键。 通过对天然态AK和突变体AK进行了修饰试剂DTNB与巯基的反应动力学发现:天然AK的修饰反应动力学为双相过程,而突变体AK-C274A为单相。天然AK和突变体AK-C274A双亚基分子表面可及性巯基分别为6和4个,其中2个活性必需的巯基修饰反应速度快,处于较正的化学微环境中(周围有较多的正电荷),其余4个具有相同的较慢的反应速度。通过比较证实,274位半胱氨酸反应速度快,位于正电荷较多的酶活性部位。 对修饰酶AK-TNB的DTT激活底物反应动力学研究进一步发现:274位反应半胱氨酸定位在接近ATP的结合位点,很可能处于精氨酸激酶的两个结构域的铰链区。可反应半胱氨酸被修饰或者被突变后,过渡态类似物并不能够诱导构象变化以适应催化反应的需要。进一步证实了,活性所必需的274位半胱氨酸,它的作用可能体现在由过渡态类似物诱导的酶分子的构象变化,而不是结合过渡态类似物上,其余半胱氨酸在这一方面可能不发挥作用。