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《清华大学》 2008年
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大肠杆菌表达CPC酰化酶基因的工程菌构建及催化研究

林晨露  
【摘要】: 头孢菌素C酰化酶(CCA)是一步酶法生产7-氨基头孢烷酸(7-ACA)的关键酶,能够将原料头孢菌素C(CPC)直接催化生成7-ACA。本论文通过人工合成获得一段源自的P. diminuta N176的头孢菌素C酰化酶基因(cpca),采用基因工程的手段,将cpca基因克隆并构建了相应的诱导型重组大肠杆菌,实现CPC酰化酶的活性表达。并研究了此酶的催化性质。 人工合成的基因经过突变优化后,证明能够在BL21(DE3)plysS/ pET24Δ体系中表达具有很高底物特异性的CCA,对CPC转化率达90%以上。将基因克隆并构建相应的组成型重组大肠杆菌J-KTHPR-fcpca、T-KToriP-cpca菌株,发现cpca基因在两体系中均无法表达。 构建了具有T7表达系统的重组质粒pET28-cpca、pET30-cpca,比较了二者在宿主JM109(DE3)中对于CPC酰化酶表达的差异。首先在BL21(DE3) plysS/pET30-cpca体系中成功的表达了CPC酰化酶基因。对质粒pET30-cpca的lacI基因进行敲除获得pET30Δ-cpca质粒,比较了二者对于CPC酰化酶表达的差异。得到最优条件,28℃、4h乳糖诱导终浓度1.0%,此时B-pET30-cpca能有最佳表达。 利用cpca上的His-tag标签,采用IMAC技术对CPC酰化酶进行纯化,纯化后的蛋白纯度达到90%以上。通过对CPC酰化酶催化性质的研究发现pH 10是CPC酰化酶催化的最佳pH,CPC酰化酶稳定性受pH影响并不大。CPC酰化酶活性随催化温度升高而升高,在55℃达到最高值。CPC酰化酶低温储存较稳定,在越高温度下储存失活越严重。22℃放置36小时,酶活损失约14%。对酶催化过程的研究表明,CPC酰化酶有较为严重的产物抑制。 本论文的研究成果为CPC酰化酶在大肠杆菌中的高活性表达以及最终实现工业化生产奠定了基础。
【学位授予单位】:清华大学
【学位级别】:硕士
【学位授予年份】:2008
【分类号】:Q78

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