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《北京工业大学》 2018年
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智能荧光纳米颗粒在MicroRNA递送及肿瘤成像与治疗中的研究

邓雄威  
【摘要】:尽管诊断技术与治疗手段在不断提高,恶性肿瘤的高发率和高死亡率依然成为威胁人类健康的最大杀手。近年来,纳米生物医学领域取得了巨大发展,纳米材料在恶性肿瘤中的成像、诊断与治疗一体化研究已成为当前研究的热点和重点。纳米材料具备特殊的物理化学性质,能够通过合成与组装技术,构建出性能稳定和安全的纳米载体材料。利用纳米载体递送治疗性基团和高准确度的成像探针技术,实现药物运输、靶向递送、活体示踪、治疗和实时监控等功能于一体的多功能纳米载体平台,为恶性肿瘤的诊疗提供了新方法和策略。传统的近红外有机荧光分子是一类能够吸收长波长(700-900 nm)近红外光子的发光染料,具备较低的自发荧光特性和深度的组织侵入性,因此被应用于生物医学成像领域。但是在高浓度下这一类分子容易产生聚集诱导淬灭现象(Aggregate Induced Quenching Effect,ACQ),并且在体内容易被清除,进而大大地限制了其更广泛与多层次的应用。近年来,越来越多的研究将有机荧光分子与纳米材料相结合,在纳米材料的多功能化、细胞与活体成像、光动力和光热治疗以及诊疗一体化等领域展开探索。以miRNA为核酸类药物,对miRNA表达进行干预的新技术,是当前肿瘤基因治疗研究中的热点领域。如何安全有效地将治疗性miRNA递送到肿瘤组织与细胞中成为研究中的难点。因而,通过非病毒纳米载体技术实现miRNA的精准递送及调控在肿瘤基因治疗中具有重要意义。本论文正是基于以上研究背景,利用近红外荧光分子的ACQ效应,通过分子自组装成功地构建了一系列具有近红外荧光“关-开”模式的智能荧光纳米颗粒,并用于miRNA基因的递送及在肿瘤中的荧光成像与基因治疗。具体工作包括以下几个方面:一、负载Cy-5荧光分子和miR-203基因纳米复合材料的制备与表征:我们设计并实现了利用鱼精蛋白硫酸盐(Protamine sulfate,PS)和纳米金刚石(Nanodiamond,NDs)两步自组装法构建同时负载水溶性的近红外荧光染料分子Cyanine-5(Cy-5)和microRNA-203(miR-203)基因的纳米复合材料(miR-203/F-PNDs),并对其各种物理化学性质进行了详细的表征。所组装的miR-203/F-PNDs具有良好的水溶性和分散性,能够以较高负载效率和吸附效率实现Cy-5分子和miR-203基因的同时包裹。纳米材料能够较好地保护miR-203,使其不受核酸酶的降解。当Cy-5分子负载进入纳米粒子后,能够形成高度聚集状态,使其荧光基本处于ACQ的关闭状态。当存在蛋白酶的情况下,能够显著加速PS的降解,进而释放出Cy-5和miR-203,从而使Cy-5分子解除高度聚集状态,从而使其荧光显著增强恢复。二、利用miR-203/F-PNDs在细胞水平和活体水平进行“成像-治疗”的生物活性评价。通过细胞内吞,miR-203/F-PNDs在细胞内能够激活它的荧光到“打开”的状态,而在细胞外和血液环境中,其荧光是处于“关闭”的淬灭态。细胞实验表明miR-203/F-PNDs能够有效地被细胞摄取,并有效地抑制细胞的增殖和迁移,同时western-blot结果和qRT-PCR结果均表明miR-203能够抑制下游基因和蛋白的表达。此外,活体小动物活体荧光成像和肿瘤组织冰冻切片实验表明,尾静脉注射24小时后,miR-203/F-PNDs可有效聚集在肿瘤部位,并通过肿瘤细胞的摄取从而激活其荧光特性。采用荷Ec-109肿瘤的Balb/c小鼠模型考察miR-203/F-PNDs的抑制肿瘤活性,尾静脉注射miR-203有效含量为2 mg/kg的纳米颗粒能够有效地抑制肿瘤的生长。此外,生化分析和主要脏器的HE分析均未发现明显病理学改变,说明了该纳米复合物具有良好的生物相容性。三、具有谷胱甘肽响应的荧光可激活的聚电解质纳米基因载体的构建:通过羧甲基葡聚糖(Carboxymethyl dextran,CMD)和具有二硫键的阳离子多肽(Arg-Arg-S-S-Arg-Arg,S-Arg_4)的自组装和分子之间的化学交联,我们设计并成功构建了具有谷胱甘肽响应的近红外荧光可“关-开”的聚电解质纳米颗粒(CMINs)。吲哚青绿(ICG)和具有广谱抑癌功能的miRNA-34a(miR-34a)同时被包裹进纳米颗粒。当ICG被包裹进入该CMINs时,能够诱导ICG荧光淬灭。当遇到高浓度的谷胱甘肽时,S-Arg_4中的二硫键会发生断裂,纳米粒子进而解离,从而实现ICG和miR-34a的同时释放。此外,随着ICG的释放,其从高度聚集态重新分散成游离态,淬灭的荧光重新恢复,实现了荧光“关-开”模式的转换,进而能够利用荧光恢复的性质来模拟miR-34a的释放比率。四、基于CMINs荧光可激活特性进行实时模拟miR-34a递送效率和实现精准肿瘤荧光成像与治疗。在细胞实验中,我们利用流式细胞和激光共聚焦实验,验证了利用CMINs递送miR-34a进入细胞的能力,并将ICG荧光强度恢复程度和qRT-PCR检测出的miR-34a水平进行对比。CMINs介导的miR-34a递送能够对下游靶基因具有较好地抑制效果,抑制细胞增殖、细胞迁移和诱导细胞凋亡,显示了较好地抗癌活性。CMINs表面富集CMD的作用,能够实现纳米颗粒在血液中的长循环和肿瘤富集能力,进一步实现肿瘤的精准荧光成像。进一步地,CMINs携带miR-34a可以有效地遏制肝癌和乳腺癌原位小鼠模型中肿瘤增长,延长荷瘤小鼠的生存期,同时并不会产生任何的毒副作用。
【学位授予单位】:北京工业大学
【学位级别】:博士
【学位授予年份】:2018
【分类号】:TB383.1;R73-3

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