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《北京理工大学》 2015年
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分子印迹膜技术及其在溶菌酶和左羟丙哌嗪检测中的应用研究

赵文涛  
【摘要】:分子印迹技术是一项以分子间作用力为基础,模仿抗原与抗体特异性结合机理的技术。它能够在复杂样品中选择性地分离某种化合物,因此近些年在生物领域和化学领域均得到了一些有益的尝试,表现出良好的应用前景,受到中外学者的广泛关注。本文将分子印迹技术与膜技术,以及光子晶体技术结合在一起,分别选择了具有代表性的生化小分子左羟丙哌嗪与大分子溶菌酶作为模板,制备了分子印迹聚合物膜,探讨了分子印迹与膜技术相结合的优势与不足,为分子印迹聚合物膜在生化传感器芯片的研究发展进行了有益的探索。绪论中首先对分子印迹技术的基本原理与制备方法进行了较为详细的介绍,分析了不同制备方法得到的分子印迹聚合物的不同与优缺点;着重介绍了分子印迹膜技术近年的发展情况以及不同种类分子印迹膜的区别,结合国内外研究者的科研成果对分子印迹膜在不同领域的应用进行了探讨;综述了光子晶体材料的相关原理与制备方法,论述了分子印迹技术、膜技术与光子晶体技术相结合的分子印迹光子晶体膜的研究意义。第二章以溶菌酶作为模板分子,丙烯酰胺为功能单体,制备了聚丙烯酰胺分子印迹聚合物膜(MIP)与作为参照的非分子印迹聚合物膜(NIP),通过聚合条件优化、吸附动力学研究等一系列实验,重点研究了它们的竞争吸附性能。通过优化分子印迹聚合物的聚合条件与洗脱条件,确定了用十二烷基磺酸钠(SDS)与乙酸作为洗脱溶液,可以良好除去分子印迹膜上的模板蛋白;在吸附实验中,探讨了不同pH条件下MIP膜吸附效果的差别,发现pH6.0,25mM的PBS缓冲液作为吸附溶液时MIP膜对模板蛋白的吸附效果最好;吸附动力学研究表明,MIP膜能够在30分钟内达到吸附平衡,利用Scatchard方程分析MIP膜的吸附数据发现在MIP膜上只存在一种结合位点,理论计算最大吸附容量为8.2mg/g;在选择性吸附实验中,MIP膜对模板蛋白溶菌酶的吸附能力远好于对其它类似蛋白的吸附能力,NIP膜对所有蛋白的吸附能力没有明显区别;使用MIP膜与NIP膜分别对混合蛋白样品进行竞争吸附实验,吸附后蛋白溶液采用SDS-PAGE电泳与高效液相色谱进行表征,结果表明:MIP膜吸附前后,溶菌酶浓度明显降低(吸附后色谱峰面积减少为吸附前的19.3%),牛血清白蛋白与卵清白蛋白的浓度下降较少(吸附后色谱峰面积减少为吸附前的71.9%和91.7%)。nip膜吸附前后蛋白浓度均没有明显的变化,mip膜与nip膜相比较,mip膜对溶菌酶的吸附效果是mip膜的5.6倍;重复性实验结果表明mip膜具有较好的重复使用性能,因此该印迹聚合物膜具有作为快速检测混合蛋白中低丰度溶菌酶的应用前景。第三章在前述研究的基础上,首次将单分散的聚苯乙烯微球作为致孔剂引入印迹聚合物膜,制备了以聚苯乙烯微球作致孔剂的溶菌酶分子印迹聚合物膜(ps-mip)。聚苯乙烯微球的添加使ps-mip膜表面形成亚微米级的孔穴,从而获得更高的比表面积,这样不但可以改善印迹聚合物膜的动力学性能,还可以在聚合物表面暴露更多的结合位点,提高印迹聚合物膜的吸附能力。本文考察看聚苯乙烯微球的添加比例、聚合体系的ph等条件对聚合效果的影响,结果表明:当添加聚苯乙烯的质量浓度为0.1%时,ps-mip膜具有最佳的印迹效果(印迹因子为6.0);比较ph条件对ps-mip膜吸附能力的影响,确定吸附溶液的最佳ph为ph6.0。除去致孔剂聚苯乙烯微球选择了四氢呋喃作为洗脱溶液,研究发现四氢呋喃作为洗脱聚苯乙烯的溶剂不会对ps-mip膜吸附性能产生明显的影响。在吸附实验中,吸附动力学研究表明,ps-mip膜能够在15分钟内达到吸附平衡,平衡时间明显短于上一章制备的mip膜;scatchard方程计算ps-mip膜的理论最大吸附量为13.0mg/g,也要明显高于mip膜吸附容量;通过选择性吸附实验结果表明,ps-mip膜对模板蛋白溶菌酶的吸附能力明显强于对其它蛋白的吸附能力;在竞争吸附实验中,ps-mip膜吸附后溶菌酶色谱峰面积变为原来的6.4%,牛血清白蛋白与卵清白蛋白的峰面积减少为85%与97%,ps-mip膜对溶菌酶的吸附效果是ps-nip膜的4.4倍;是mip膜的1.2倍。同未添加致孔剂的mip膜相比较,ps-mip膜有效的提高了吸附时间,对溶菌酶的选择性更高,吸附容量也更大,同相关参考文献相比较,ps-mip膜得到了更高的印迹因子。因此,在作为实际样品中痕量溶菌酶快速检测的领域,ps-mip膜比mip膜具有更大的优势。第四章首次采用生化小分子左羟丙哌嗪(ldpz)作为模板分子,甲基丙烯酸(maa)作为功能单体,2-羟乙基甲基丙烯酸酯(hema)作为辅助功能单体,在光子晶体结构内进行分子印迹聚合,制备了左羟丙哌嗪分子印迹光子晶体膜(mipc)。分子印迹光子晶体的研究只要集中在兼性的离子和盐类化合物的分析检测,很少应用于碱性化合物的检测,本研究通过分子印迹技术、膜技术与光子晶体技术的交叉融合,扩展了分子印迹光子晶体在碱性化合物检测中的应用。其基本原理是当MIPC膜识别模板分子并与之结合后,MIPC的微结构尺寸就会发生细微的改变,从而导致MIPC膜的吸收峰位移发生改变。本章优化了聚合体系的构成,确定了模板分子、功能单体、辅助功能单体与交联剂的比例,使分子印迹聚合物能够同时保持良好的选择吸附性能与溶胀性能;制备了粒径为240nm的单分散硅胶颗粒,并使用胶体自组装的方法制备了光子晶体膜,然后在光子晶体中引入分子印迹聚合体系,加热聚合后氢氟酸刻蚀除去硅胶颗粒,就得到了MIPC膜。结果表明:MIPC膜在25mM、pH6.0的磷酸盐缓冲液中对LDPZ的吸附效果最好,吸附平衡时间为30分钟;在选择性吸附实验中,MIPC膜对LDPZ进行吸附后的吸收峰位移变化明显大于对结构类似物吸附后吸收峰的位移变化,这表明MIPC膜对LDPZ具有良好的选择性,重复性实验也表明MIPC膜具有良好的重复使用性能,因此具备作为试纸或传感芯片应用于LDPZ的快速、灵敏检测的应用前景。本研究制备了溶菌酶分子印迹聚合物膜(MIP)与添加有致孔剂聚苯乙烯微球的分子印迹膜(PS-MIP),研究结果表明,致孔剂的添加有效的提高了分子印迹膜的印迹吸附性能,为分子印迹聚合物应用于生化传感器检测实际样品中的蛋白质提供了参考;其次将分子印迹技术、膜技术与光子晶体技术相结合,利用具有周期性结构的胶体颗粒组装体作为模板,并以左羟丙哌嗪作为印迹分子,制备了具有有序大孔结构的分子印迹薄膜,实现了对印迹分子的光学响应识别。随着溶液中左羟丙哌嗪浓度的增加MIPC膜的特征衍射峰发生红移,这为把MIPC膜作为试纸或传感芯片应用于左羟丙哌嗪的快速、灵敏检测打下良好基础。
【学位授予单位】:北京理工大学
【学位级别】:博士
【学位授予年份】:2015
【分类号】:O631.3

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