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《北京理工大学》 2015年
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流感病毒裂解疫苗中外源性禽白血病病毒荧光定量PCR检测方法的研究

刘巍  
【摘要】:流感病毒裂解疫苗作为预防大规模流感疫情的重要预防手段,能有效的预防流感引起的疾病和死亡。接种流感疫苗是被公认的预防流感发生与传播的最佳方法,用鸡胚作为病毒生长介质也是目前流感疫苗生产最常用的培养基质。在2010版《中国药典》新增流感病毒裂解疫苗品种,其中规定明确要求对其主种子批中的外源性禽白血病病毒(Avian Leucosis Virus,ALV)进行检测,检测结果应为阴性。禽白血病病毒的检测目前主要依赖于病毒分离培养及酶联免疫吸附。血清学诊断由于检测时间长,需制备特异性抗体,存在生物安全隐患等不足之处。随着分子生物学检测技术的发展,为禽白血病病毒的准确检定提供了可能。应用普通PCR和RT-PCR方法可在1天内进行禽白血病病毒的鉴定和分型诊断,但两种方法均易造成标本间的交叉污染而得到假阳性结果。Taqman实时荧光定量PCR技术,相对于常规的PCR技术而言,具有更高的敏感性、特异性。而且还具有快速、高通量、污染少等优点。从GenBank下载ALV-A、ALV-B、ALV-C、ALV-J等病毒基因组序列,寻找位于LTR区域的保守序列,设计引物探针。扩增保守区,获得质粒标准品,将含有保守序列的质粒标准品经过10倍系列稀释后,进行荧光定量PCR得到相应的扩增曲线和标准曲线。得到的标准曲线相关系数R2=0.998,扩增效率Eff=96.5%所做的标准曲线的有较好的线性关系。倍比稀释质粒标准品,从1×109稀释到1×101copies/μL。考察其敏感性,敏感性可达到10-1copies/μL。用建立的荧光定量PCR方法对ALV-A、ALV-B、ALV-C、ALV-J等标准质粒进行检测,均可出现“S”型扩增曲线。说明该方法可检测四种亚型的禽白血病病毒。用建立的荧光定量PCR方法对小鼠白血病病毒、H1N1型流感病毒、H7N9型流感病毒等进行检测,扩增结果皆为阴性。表明所建立的针对外源性禽白血病病毒的荧光定量PCR方法特异性强,与其他病毒无交叉反应。本研究成功设计了针对外源性禽白血病病毒的特异性引物和探针,可实现对流感病毒裂解疫苗主种子批中的禽白血病病毒的快速检定,具有快速、敏感、特异等特点,并可对样品中病毒进行定量。
【关键词】:禽白血病病毒 外源性 荧光定量PCR
【学位授予单位】:北京理工大学
【学位级别】:硕士
【学位授予年份】:2015
【分类号】:S852.65;R373
【目录】:
  • 摘要5-7
  • Abstract7-11
  • 第1章 绪论11-24
  • 1.1. 引言11-12
  • 1.2. 禽白血病病毒研究现状12-24
  • 1.2.1. 病原学特点13-14
  • 1.2.2. 病毒基因组的复制14-15
  • 1.2.3. 禽白血病病毒长末端重复序列(ALV LTR)15-16
  • 1.2.4. 实验室检测方法16-21
  • 1.2.5. 实时荧光定量 PCR(Real-Time quantitative PCR,QPCR)21-24
  • 第2章 材料和方法24-34
  • 2.1. 材料24-25
  • 2.1.1. 毒株来源24
  • 2.1.2. 主要试剂24
  • 2.1.3. 主要实验仪器24-25
  • 2.2. 方法25-32
  • 2.2.1. 引物和探针的设计与合成25-26
  • 2.2.2. 禽白血病病毒的传代培养26
  • 2.2.3. 禽白血病病毒的RNA提取26-27
  • 2.2.4. 禽白血病病毒逆转录27-28
  • 2.2.5. 阳性标准质粒的制备28-31
  • 2.2.6. 禽白血病病毒荧光定量PCR反应标准曲线的制作31
  • 2.2.7. 禽白血病病毒荧光定量PCR敏感性的检测31
  • 2.2.8. 禽白血病病毒荧光定量PCR特异性的检测31-32
  • 2.3. 禽白血病病毒荧光定量PCR方法的验证32-34
  • 2.3.1. ELISA检测32
  • 2.3.2. 荧光定量PCR检测32-34
  • 第3章 禽白血病病毒荧光定量PCR检测方法的建立34-39
  • 3.1. 禽白血病病毒目的基因的扩增和鉴定34-35
  • 3.2. 阳性标准品的标准曲线的制作结果35-36
  • 3.3. 敏感性检测结果36
  • 3.4. 特异性检测结果36-38
  • 3.5. 讨论38-39
  • 第4章 禽白血病病毒荧光定量PCR检测方法的验证39-42
  • 4.1. ELISA检测结果39-40
  • 4.2. 荧光定量PCR检测结果40
  • 4.3. 讨论40-42
  • 结论42-43
  • 参考文献43-47
  • 致谢47

【参考文献】
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