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《北京科技大学》 2017年
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多环芳烃降解菌的筛选及基于靶标酶结构的降解机制研究

靳竞男  
【摘要】:在本研究中,我们以原油为研究对象筛选出了高效的多环芳烃(PAHs)降解菌,对其降解能力、降解产物、生物活性及底物利用范围进行了研究;通过同源模建方法得到了靶标酶的三维晶体结构,利用分子对接技术对PAHs与靶标酶活性位点之间的结合状况和相互作用机制进行了研究。具体研究内容如下:1.以高浓度的芘和荧葸为唯一碳源从大港油田的原油样本中筛选得到了两株高效的芘和荧蒽降解菌,分子生物学鉴定结果表明:芘降解菌属于假单胞菌属,命名为Pseudomonas. sp. JPN2;荧蒽降解菌属于微杆菌属,命名为Microbacterium paraoxydans JPM1。2.芘降解菌JPN2在25 d的降解试验之后,对芘的降解率达到了82.88%。在液相降解体系中共检测到五种芘降解产物:4,5-二羟基-4,5-二氢芘、4-菲酚、1-羟基-2-萘甲酸、1-羟基萘和邻苯二甲酸。在此基础上,我们推测芘在菌株JPN2中的生物降解起始于C4-C5原子的双羟基化反应,并涉及了邻苯二甲酸路径。菌株JPN2具有广泛的底物利用范围,能够有效利用芘之外的其它15种芳香性和非芳香性化合物作为唯一生长底物。其中,JPN2能够有效利用水杨酸作为唯一生长底物,说明了在JPN2中可能同时存在水杨酸降解路径。此外,微量热测试结果表明JPN2对芘具有高度的耐受性,在100~400 mg/L芘浓度下,菌株JPN2的生长活性几乎不受影响。3.利用PCR扩增出了菌株JPN2中编码萘双加氧酶α大亚基的nahAc基因序列,经过基因序列的ORF分析翻译得到了靶标酶的氨基酸序列;以107N为模板,利用同源模建方法构建出了菌株JPN2体内萘双加氧酶α亚基的三维晶体结构模型(JPN2-NDO),并对JPN2-NDO进行了分子动力学优化和基于Ramachandran检测图的结构合理性验证。4.利用分子对接方法研究了芘和JPN2-NDO活性位点之间的结合方式和相互作用机制。理论分析结果表明,芘分子结构中的C4和C5原子是距离双氧分子最近的碳原子,并且能够与其周围的氨基酸残基和辅因子发生相互作用,在理论上该位点是最易于被激活后的氧原子进攻并发生双氧化反应的位置。同时,降解产物的4,5-二羟基-4,5-二氢芘的鉴定结果也同时验证了分子模拟研究的理论分析结果。最终,基于降解产物鉴定和理论分析结果揭示了芘在菌株JPN2体内的生物降解机制。5.荧葸降解菌JPM1的生物降解能力与细菌的生长活性成正相关性。在25 d的降解试验结束之后,菌株JPM1对荧蒽的降解率达到了91.78%。在荧蒽的生物降解过程中共检测到四种降解产物:9-芴酮-1-羧酸、9-芴酮、邻苯二甲酸和苯甲酸。菌株JPM1能够利用荧蒽之外的其它12种含碳化合物作为唯一生长底物,具有较广泛的底物利用范围。微量热法分析结果表明:低浓度的荧蒽(25 mg/L)对JPM1的生长活性有促进作用;在100-400 mg/L浓度时,荧蒽对JPM1生长活性的影响非常微弱;当荧蒽浓度升高至1600和3200 mg/L时,其抑制率分别达到了12.80%和30.34%。在低浓度的芘和荧蒽存在下,JPN2和JPM1表现出相似的抑制效果,但是在较高浓度条件下二者的抑制率出现显著的区别。6.在酶的活性空腔结构比对中发现,靶标酶JPN2-NDO和模板107N的活性位点中共有6个氨基酸位点存在差异。107N中亲水性的Thr308在‘JPN2-NDO中由疏水性的Va1232替代,这种替换能够增加活性位点的疏水性,有利于芘的结合。Ser225、Met306、Trp358和Glu359分别替换为Gln149、 Ala230、Tyr267和Ser268,后者具有更小的体积,但极性保持不变。亲水性的中性氨基酸Tyr207替换为体积更小的疏水性的Leul31,这种替换有利于减小活性空腔以及空腔入口处的空间位阻效应,更加有利于疏水性的高分子量PAHs与活性空腔之间的结合作用。酶活性位点之间的这种结构差异可能是导致不同种属细菌之间产生生物活性差异的主要因素之一。本研究为PAHs降解菌进一步的基因修饰与改造、以及在污染位点中的实际应用提供了相应的理论依据。
【学位授予单位】:北京科技大学
【学位级别】:博士
【学位授予年份】:2017
【分类号】:X172

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