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羧基化二氧化硅纳米粒子的制备及其对酶及辅酶固定化的研究

孙丽卫  
【摘要】:本论文系统研究了羧基化二氧化硅纳米粒的制备过程及其在固定化木瓜蛋白酶(EC:3.4.22.2,木瓜酶)及辅酶NAD+方面的应用。首先采用两步化学改性(烷基化、羧基化)制备了活性二氧化硅纳米粒载体。通过对载体制备条件的优化,得出最佳制备条件,结果显示,硅烷与纳米粒用量为1.8ml/g纳米粒时,氨基化含量达到最大,戊二酸酐添加比例为2.5g/g纳米粒时,反应3h即可达到载体的最大羧基化。采用热重、傅里叶红外光谱等手段对羧基化二氧化硅纳米粒载体进行了表征,通过对相关谱图的分析表明,二氧化硅纳米粒载体实现了氨基化及羧基化。 在促进剂碳二亚胺(EDC)脱水作用下,将制备出的羧基化二氧化硅纳米粒载体用于木瓜酶的共价固定化。结果显示,二氧化硅纳米粒载体的固载量为4.96mg酶/g载体且最佳给酶量为10mg/g SiO2,最佳固定化温度及pH分别为70℃及7.0。 对固定化木瓜酶与游离木瓜酶的酶学性质进行了比较,并研究了固定化木瓜酶对茶饮料的澄清效果。结果显示,与游离酶相比固定化酶的稳定性有明显提高,包括温度及pH稳定性,并且固定化酶对4种常见无机盐离子及4种常见有机溶剂的耐受性增强。此外,本文将所制备的固定化木瓜蛋白酶用于茶饮料澄清方面具有明显效果,从结果中可以看出,茶汤中可溶性蛋白含量由119.39μg/ml下降为86.60μg/ml,氨基酸含量由116.58μg/ml上升到123.45μg/ml,且固定化酶处理后的茶汤透光率随时间基本不发生变化。 同样,基于促进剂碳二亚胺(EDC)的脱水作用实现了羧基化二氧化硅纳米粒载体上活性羧基与辅酶大分子上的非活性位点氨基选择性共价连接,成功制备了纳米粒固定化辅酶NAD+。通过实验确定最佳固定化条件,纳米粒固定化辅酶的最佳固定化温度及pH分别为35℃及5.0,最佳固定化时间及给酶量分别为28h及500mg/g载体。与游离酶相比固定化辅酶NAD+的储存稳定性得到提高且重复使用5次后仍然能保留一定的活性。


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