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《北京化工大学》 2013年
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基于λ-Red重组系统构建3-羟基丙酸工程菌

曹宁  
【摘要】:3-羟基丙酸(3-Hydroxypropionic acid,3-HP)是一种多功能高值化学品。基因工程菌发酵生产3-HP是目前的研究热点。本研究以耐受高浓度甘油的肺炎克雷伯氏菌(Klebsiella pneumoniae DMS2026)为出发菌株,构建基于串联表达载体和λ-Red同源重组技术的工程菌,并对工程菌生产3-HP的能力进行了探索,具体研究内容如下: 1、克隆了K. pneumoniae甘油脱水酶基因dhaB和醛脱氢酶基因puuC,构建了由甘油脱水酶自身组成型启动子pk调节的串联表达载体pET-pk-dhaB-puuC,电击转化K. pneumoniae DSM2026,获得重组菌K. p(pET-pk-dhaB-puuC),进行微氧摇瓶发酵及上罐发酵。结果:微氧摇瓶发酵15h后,重组菌的3-HP产量达到最大值7.2g/L,分别为野生型K. pneumoniae和K. p(pET-pk)的6.79和8.47倍,副产物乳酸和乙酸浓度也为整个发酵周期最低值的0.49g/L和1.07g/L;上罐发酵在维持低副产物水平的同时,3-HP产量达到14.2g/L,因此确定重组菌的最佳发酵周期为15h。 2、克隆了酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)的3-磷酸甘油脱氢酶基因GPD1,在pET-pk-dhaB-puuC基础上,构建了耦合3-HP生产与NAD+再生的串联表达载体pET-pk-dhaB-puuC-GPD1,对重组菌K. p(pET-pk-dhaB-puuC-GPD1)进行微氧摇瓶发酵。结果:引入GPD1后,重组菌生物量较K. p(pET-pk-dhaB-puuC)有明显提升,而3-HP最高值降为1.45g/L,分别为野生型K. pneumoniae和K.p(pET-pk)的1.93倍和2.39倍,乙酸浓度为发酵周期最低值0.54g/L。 3、克隆了λ-Red同源重组系统所需的重组酶基因beta、gam、exo以及上游启动子序列区,构建重组质粒pET-ParaB-Red,并成功转化K.pneumoniae DMS2026,得到重组菌K. p(pET-ParaB-Red)。L-阿拉伯糖梯度诱导实验表明,在40mmol/L L-阿拉伯糖诱导90min后重组酶获得最佳表达量。 将连续三轮易错PCR扩增的副产物基因片段lldD、pta、poxB经三轮电击转化至重组菌K. p(pET-ParaB-Red),通过高通量筛选获得了两株性状明显的突变菌株K. pneumoniae(32#)和K. pneumoniae(25#)。摇瓶发酵实验结果:K. pneumoniae(32#)的副产物乙酸和乳酸维持在0.4g/L以下,而3-HP也持续低表达,最高值仅为0.33g/L。K. pneumoniae(25#)3-HP产量浓度最高达到0.96g/L;但在副产物生产上,只能较好地控制乳酸水平(<0.4g/L),而乙酸维持在1.5g/L左右波动。此外,测序结果表明,两株菌在核酸及氨基酸水平上都发生了不同变化;连续传代实验表明,两株重组菌的突变均能稳定遗传,没有发生回复突变。
【学位授予单位】:北京化工大学
【学位级别】:硕士
【学位授予年份】:2013
【分类号】:Q78;Q93

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