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《北京化工大学》 2013年
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第三代生物柴油的开发研究

刘军锋  
【摘要】:生物柴油是一种重要的可再生能源,其生产方法是将原料油脂和短链醇在催化剂的催化下,转化合成生物柴油(如脂肪酸甲酯/脂肪酸乙酯)。生物柴油已在各国广泛生产和应用,2008年全球生物柴油产量已达到1400万吨,近几年生物柴油产量正以较快的速度增长。目前,原料成本高、生产工艺较复杂是生物柴油生产工艺中主要问题。因此,如何利用微生物直接发酵生产生物柴油,建立一种高效的、可替代石化柴油和现有生物柴油生产的新技术、新路线显得日益迫切。 本论文分别从长链生物柴油基因工程菌的构建及发酵条件优化,中链脂肪酸乙酯的合成、中链脂肪酸及其乙酯基因工程菌的构建等方面进行了研究。 1.构建了产长链生物柴油的酿酒酵母基因工程菌。通过重组质粒的构建、转化和重组子筛选,导入质粒YEp352-PLC的重组酿酒酵母表达了大小约为42KDa的重组蛋白,脂肪酶的比活力为12.12U/mg,胞内油脂中长链脂肪酸含量超过92%。发酵培养96h,提取的重组酿酒酵母油脂中脂肪酸乙酯产量约为3.7mg/g (DCW)。 2.为了提高重组酿酒酵母脂肪酸乙酯产量,利用响应面法优化了酿酒酵母产油脂发酵条件。在优化的发酵条件下,重组酿酒酵母油脂产量比对照提高了2倍左右,达到14.55%。 3.通过均匀设计优化了酿酒酵母联产油脂和乙醇的发酵条件。考察了通气量、搅拌速率和葡萄糖流加对酿酒酵母产油脂和乙醇的影响,通过非线性拟合得到两个相关性在90%的方程。分析表明,搅拌速率对酿酒酵母产油脂和乙醇的影响大于其它两个因素。通过计算得到产油脂、产乙醇、联产油脂和乙醇的最优条件,并得以实验验证。 4.优化了酿酒酵母工程菌产脂肪酸乙酯的发酵条件。在酿酒酵母产油脂发酵条件的基础上,3次添加反应体系体积4%的乙醇效果最佳,所得到的FAEEs量达到11.4mg/g (DCW)。 5.开发了利用樟树籽油合成中链生物柴油的合成工艺。首先利用正交实验优化了微波辅助萃取法提取樟树籽油的提取条件,油脂提取率达到90%以上,樟树籽油中脂肪酸组成以癸酸(53.4%)和月桂酸(38.7%)为主,中链脂肪酸含量占脂肪酸总含量的94%。其次采用固定化脂肪酶Candida sp.99-125催化樟树籽油合成生物柴油(脂肪酸乙酯),优化后的合成工艺条件为:水含量10%(wt),酶用量15%(wt),油/醇摩尔比1:3.2,9次流加乙醇(间隔时间2.67h),反应温度40-C,摇床转速170rpm,反应24h,脂肪酸乙酯产率达93.5%。 6.构建了产中链脂肪酸的基因工程菌。克隆樟树硫酯酶基因ccFatB并转入大肠杆菌表达。重组大肠杆菌发酵培养产物中,肉豆蔻酸产量为52mg/L,占总脂肪酸含量的10.6%。 7.构建了产中链生物柴油的基因工程菌。克隆不动杆菌酰基转移基因atfA和ccFatB,构建了双基因表达载体pETDuet-ccFatB-atfA,转入大肠杆菌表达。基因工程菌利用外源流加4%的乙醇在胞内合成脂肪酸乙酯,肉豆蔻酸乙酯产量约为2.1mg/L,占乙酯总量的10%。
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