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《北京化工大学》 2016年
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肺炎克雷伯氏杆菌与大肠杆菌代谢调控及转录传感元件的研究

陈柳霓  
【摘要】:3-羟基丙酸(3-HP)为非手性有机酸,化学性质活跃,可转化为一系列重要化合物,且具有化学变通性。目前,商业化生产3-HP多为化学合成法,成本高、转化率低、分离纯化难度大,使得其生产方法亟待完善。微生物法产3-HP具有成本低和污染少等优势。随着合成生物学的发展,微生物生产3-HP引起人们关注。然而,微生物产3-HP的模式化生产仍然存在挑战。3-HP的研究需从多方面提高其产量和底物转化率,比如代谢调控、转录调控等。为此,本实验对肺炎克雷伯氏杆菌(Klebsiella pneumoniae)与大肠杆菌(Escherichia coli)的代谢调控及转录传感元件进行了研究。本实验设计与工作包括以下三方向内容:1.K. pneumoniae中转录传感元件与pk启动子相互作用的研究。考察了RNA聚合酶的σ因子与甘油脱水酶pk启动子的亲和性,旨在增强3-HP合成基因的转录表达,提高3-HP的产量。实验筛选了3个sigma因子rpoE、rpoS、dksA并对其进行超表达。引入卡那霉素抗性基因的启动子Pkana以排除甘油脱水酶自身的pk启动子对此3个因子超表达的干扰,采用绿色荧光蛋白基因(gfp)以验证表达量的强弱。结果发现,rpoE的表达增强了pk启动子的效率。于是将醛脱氢酶的基因ald4替换gfp,得到重组菌K. pneumoniae(pET-pk-ald4-pkana-rpoE)。酶活和SDS-PAGE分析发现,ald4的酶活所提高,SDS-PAGE中显示ald4的表达条带。摇瓶发酵结果显示,重组工程菌K. pneumoniae(pET-pk-ald4-pkana-rpoE)的3-HP产量是对照组K. pneumoniae(pET-pk-ald4)的1.6倍。上罐发酵结果表明,重组菌K. pneumoniae(pET-pk-ald4-pkana-rpoE)的3-HP和1,3-丙二醇(1,3-PD)的转化率分别为0.105 mol/mol和0.34 mol/mol,总转化率为0.445 mol/mol。3-HP和1,3-PD的产量得以显著提高。因此,rpoE和pk启动子的适配性更高,提高了pk启动子的转录效率,促进了后续基因的转录翻译。2. E. coli和K. pneumoniae的共培养研究。构建出携带不同抗性的K.pneumoniae与E. coli,以辨别并探究两菌的混菌体系。因此,克隆了E.coli中的cm基因,构建了重组工程菌E. coli(pET-cm)和K. pneumoniae(pET-28a)。E. coli(pET-cm)携带氯霉素和卡那霉素双重抗性,而K. pneumoniae(pET-28a)只携带卡那霉素抗性。考察了K. pneumoniae与E. coli单独培养和共培养的相对菌落数及存活率,结果显示,共培养中E. coli受到的生长抑制比K. pneumoniae更大,K. pneumoniae为共培养中的优势菌种。3.针对K. pneumoniae中3-HP代谢分向的研究。弱化K. pneumoniae中产3-HP的副产物途径,降低或消除其中一些副产物对3-HP的影响。本实验设计以提高3-HP的产量为前提,探究3-HP代谢流之间的相互关系。实验涉及K. pneumoniae甘油途径中的八个相关酶基因:pmd(KPN 01632)、poxB(KPN 00904)、frdB(KPN 04552)、fumC(KPN 01517)、 dhaT(KPN 03491)、ilvH(KPN 00083)、adhP(KPN 01853)和pflB(KPN 00931)。分别敲除了以上8个酶基因,弱化了八条代谢分支途径,构建了八株单基因敲除工程菌。对8株单基因敲除工程菌途径代谢物进行检测,分析单基因敲除工程菌中代谢流的变化,筛选出高产3-HP的工程菌。此外,对筛选出的最合适的两种酶基因进行组合敲除,测定组合敲除菌途径中代谢物的变化。在组合敲除菌中导入高产3-HP重组质粒tac-puuC,分析代谢物产量。由8株单基因敲除工程菌的摇瓶发酵结果可知,K.pneumoniae (△adhP)、K. pneumoniae(△pflB)的3-HP和1,3-PD相对产量较高,更适合做多基因敲除的表达宿主。由组合敲除菌的摇瓶和上罐发酵结果可知,K. pneumoniae △adhP△pflB (tac-puuC)在60 h时3-HP的产量达到了66.91 g/L,1,3-丙二醇的产量达到了3.85 g/L。此外,该重组菌K. pneumoniae △adhP△pflB (tac-puuC)的乳酸产量最高只为19.40 g/L,副产物的产量降低至对照组的1/3。该菌是生产3-HP的理想菌株。
【关键词】:肺炎克雷伯氏杆菌 大肠杆菌 代谢调控 sigma因子 3-羟基丙酸
【学位授予单位】:北京化工大学
【学位级别】:硕士
【学位授予年份】:2016
【分类号】:R378;Q78
【目录】:
  • 摘要4-8
  • ABSTRACT8-21
  • 第一章 绪论21-31
  • 1.1 3-HP简介21-22
  • 1.2 3-HP的合成方法22-23
  • 1.2.1 化学合成22
  • 1.2.2 生物合成法22-23
  • 1.2.2.1 涉及3-HP的微生物代谢作用22
  • 1.2.2.2 3-HP的生物合成途径22-23
  • 1.3 K.pneumoniae与E.coli23-24
  • 1.4 混菌体系概述24-25
  • 1.5 RNA聚合酶在转录调控方面的研究25-26
  • 1.5.1 RNA聚合酶概述25-26
  • 1.5.2 转录调控元件的研究26
  • 1.5.3 基于σ因子转录调控在改进细胞表型方面的研究26
  • 1.6 代谢调控概述26-27
  • 1.7 合成生物学方法27
  • 1.8 基因敲除技术27-29
  • 1.8.1 RecA系统28
  • 1.8.2 Red重组系统28
  • 1.8.3 ZFN技术和TALEN技术28
  • 1.8.4 CRISPR技术28-29
  • 1.9 立项意义29-31
  • 第二章 基于σ因子转录调控在改进细胞表型方面的研究31-49
  • 2.1 引言31
  • 2.2 实验材料31-33
  • 2.2.1 菌株、培养基和培养条件31-32
  • 2.2.2 基因和重组质粒32
  • 2.2.3 实验仪器和试剂32-33
  • 2.3 实验方法33-38
  • 2.3.1 重组菌的构建33-36
  • 2.3.1.1 基因组的提取33-34
  • 2.3.1.2 质粒的提取34
  • 2.3.1.3 PCR反应体系及其产物的回收34
  • 2.3.1.4 切胶回收34-35
  • 2.3.1.5 双酶切反应和DNA连接反应35
  • 2.3.1.6 琼脂糖凝胶电泳35
  • 2.3.1.7 热转化法35-36
  • 2.3.1.8 电转化法36
  • 2.3.2 绿色荧光蛋白分析36
  • 2.3.2.1 制样36
  • 2.3.2.2 流式细胞仪使用方法36
  • 2.3.3 酶活分析36-37
  • 2.3.4 摇瓶和上罐发酵37
  • 2.3.5 SDS-PAGE分析37-38
  • 2.3.5.1 蛋白电泳的制样37
  • 2.3.5.2 浓缩胶和分离胶的制备37-38
  • 2.3.5.3 染色液和脱色液的制备38
  • 2.3.6 代谢物分析方法38
  • 2.4 结果与讨论38-47
  • 2.4.1 K.pneumoniae基因组的提取38-39
  • 2.4.2 GFP、Pkana、rpoE、rpoS、dksA及ald4基因的克隆39-40
  • 2.4.3 GFP、Pkana、rpoE、rpoS、dksA及ald4基因的连接转化40-41
  • 2.4.4 流式细胞仪检测GFP表达量41-42
  • 2.4.5 重组菌的ALD4酶活分析42-43
  • 2.4.6 SDS-PAGE分析43-44
  • 2.4.7 摇瓶发酵分析44-46
  • 2.4.8 K.pneumoniae(pET-pk-ald4-pkana-rpoE)上罐发酵的研究46-47
  • 2.5 本章小结47-49
  • 第三章 大肠杆菌和肺炎克雷伯氏杆菌的共培养研究49-59
  • 3.1 引言49
  • 3.2 实验材料49-50
  • 3.2.1 菌株、培养基和培养条件49-50
  • 3.2.2 基因和重组质粒50
  • 3.2.3 实验仪器和试剂50
  • 3.3 实验方法50-54
  • 3.3.1 重组菌的构建50-53
  • 3.3.1.1 质粒的提取51
  • 3.3.1.2 cm基因的克隆51-52
  • 3.3.1.3 cm基因的切胶回收52
  • 3.3.1.4 pET-cm载体的酶切连接反应52
  • 3.3.1.5 琼脂糖凝胶电泳52
  • 3.3.1.6 载体pET-cm的热转化52-53
  • 3.3.1.7 载体pET-28a的电转化53
  • 3.3.2 重组工程菌的培养53
  • 3.3.3 分析测定53-54
  • 3.4 结果与讨论54-57
  • 3.4.1 工程菌E.coli(pET-cm)和K.pneumoniae(pET-28a)的构建54
  • 3.4.2 共培养和单独培养菌体生物量的分析54-55
  • 3.4.3 菌落数的测定55-57
  • 3.5 本章小结57-59
  • 第四章 肺炎克雷伯氏杆菌中3-羟基丙酸代谢分向的研究59-77
  • 4.1 引言59
  • 4.2 实验材料59-61
  • 4.2.1 菌株、培养基和培养条件59-60
  • 4.2.2 基因和重组质粒60
  • 4.2.3 实验仪器和试剂60-61
  • 4.3 实验方法61-66
  • 4.3.1 RecA重组系统61-62
  • 4.3.2 八个单敲除载体和菌株的构建62-64
  • 4.3.2.1 基因组模板的提取62
  • 4.3.2.2 pET-cm质粒的提取62
  • 4.3.2.3 同源臂基因序列的PCR反应体系及其产物回收62-63
  • 4.3.2.4 同源臂基因序列切胶回收63
  • 4.3.2.5 双酶切反应和DNA连接反应63
  • 4.3.2.6 琼脂糖凝胶电泳63-64
  • 4.3.2.7 热转化法64
  • 4.3.2.8 敲除质粒的电转化法64
  • 4.3.3 单基因敲除与双基因敲除64
  • 4.3.3.1 单基因敲除64
  • 4.3.3.2 双基因敲除64
  • 4.3.4 摇瓶和上罐发酵64-65
  • 4.3.5 SDS-PAGE分析65-66
  • 4.3.5.1 蛋白电泳的制样65
  • 4.3.5.2 浓缩胶和分离胶的制备65-66
  • 4.3.5.3 染色液和脱色液的制备66
  • 4.3.6 代谢物分析方法66
  • 4.4 结果与讨论66-76
  • 4.4.1 八个单基因敲除菌和K.pneumoniae(tac-puuc-△adhP-△pflB)的构建66-69
  • 4.4.2 单基因敲除菌的摇瓶发酵分析69-71
  • 4.4.3 K.pneumoniae △adhP△pflB(tac-puuC)的摇瓶发酵分析71-74
  • 4.4.4 K.pneumoniae △adhP△pflB(tac-puuC)的上罐发酵分析74-75
  • 4.4.5 SDS-PAGE分析75-76
  • 4.5 本章小结76-77
  • 第五章 总结与展望77-79
  • 5.1 总结77
  • 5.2 创新点77-78
  • 5.3 展望78-79
  • 参考文献79-83
  • 附录83-85
  • 附录1 本研究用到的试剂83-84
  • 附录2 本研究所用到的仪器84-85
  • 致谢85-87
  • 导师和作者简介87-89
  • 研究成果及发表的学术论文89-90
  • 北京化工大学专业学位硕士研究生学位论文答辩委员会决议书90-91

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