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氧自由基在三孢布拉氏霉菌代谢番茄红素过程中的作用机制

徐欢  
【摘要】: 活性氧是微生物细胞在正常代谢过程中产生的一类化学性质及其活泼的基团分子,主要包括超氧自由基(O_2~-)、过氧化氢(H_2O_2)和羟基自由基(OH·)。当其产生速度超过细胞抗氧化物防御系统的清除能力时,活性氧就会攻击细胞成分引发一系列毒性效应,造成对细胞的“氧化胁迫”作用。微生物为了生存必然对这种胁迫做出应答或应激相应,通过自身的抗氧化防御系统降低活性氧的危害,从而表现为不同的生物学效应。在微生物对活性氧胁迫的应激过程中,抗氧化物酶活性的变化能直接反映细胞对胁迫应答水平的指标。研究微生物对活性氧胁迫的应答机制将有助于人们了解氧自由基在微生物体内代谢的原理。 本文以β-胡萝卜素(β-carotene)和番茄红素(lycopene)的高产菌株三孢布拉氏霉菌(Blakeslea trispora)为研究菌株,以其胞内重要的抗氧化物酶——过氧化氢酶(CAT)为主要目标酶,利用不同的活性氧发生源研究不同活性氧单独胁迫(H_2O_2)、不同协同方式(瞬间和持续)胁迫下Blakeslea trispora以CAT合成为特征的应激响应,及其在氧胁迫下生成次级代谢产物番茄红素产量的变化情况。在此基础上,深入探讨CAT在B.trispora抵抗活性氧胁迫和各种环境压力胁迫中的关键作用。 论文内容主要包括以下几方面: (1)为了获得适宜的胁迫环境,首先研究了影响CAT合成的营养条件和环境条件,以及菌体代谢产生番茄红素的适宜条件。结果表明,有利于CAT合成的最优培养机组成为(g·L~(-1)):玉米淀粉40,大豆饼粉70,KH_2PO_41.5,MgSO_4 0.2,有利于番茄红素合成的最优培养机组成为(g·L~(-1)):玉米淀粉40,大豆饼粉50,KH_2PO_4 1.5,MgSO_4 0.2。有利于CAT较适宜的环境条件组合为:初始pH为6.5,最佳温度29℃,摇瓶最佳装液量为80ml/500ml。 (2)在摇瓶中采用一次性添加H_2O_2的方法研究H_2O_2瞬时刺激对CAT合成的影响,结果表明,初始添加H_2O_2,CAT活性较高,随着H_2O_2浓度的增加,CAT活性迅速降低。但是低浓度的H_2O_2却能刺激B.trispora细胞生长。番茄红素的产量随H_2O_2在一定浓度范围内有所增加。研究表明,在B.trispora发酵生长36小时添加75μmol/LH_2O_2,可以产生较多的番茄红素,此时CAT合成能力较低。 (3)采用流加H_2O_2的方式考察H_2O_2持续胁迫下B.trispora细胞番茄红素和CAT合成的应激响应,结果表明,H_2O_2的胁迫程度直接影响着CAT的合成,而CAT的合成水平又决定了菌体代谢产生番茄红素的能力。在研究多次添加H_2O_2对菌体的影响作用时(每次添加50μmol·L~(-1)),当在48和60小时添加H_2O_2,CAT活性达450U/g·min,较对照提高了28.9%。在考察H_2O_2总浓度不变、添加次数对菌体的影响时(总浓度为150μmol·L~(-1)),随着添加次数的增加,CAT合成能力随之提高,在24、36、48、60、72小时分五次添加H_2O_2时CAT合成量达到最大值(580.8U/g·min),比对照提高了97.4%;而在24、36、48小时添加H_2O_2菌体生成的产物番茄红素最多(278.4 mg·L~(-1)),比对照提高了24.5%。 (4)CAT合成是B.trispora固有的性质,在B.trispora生长和代谢过程中起着某种保护作用。当细胞内的氧自由基在CAT能够承受的范围内时,菌体正常生长;当氧自由基大量形成而消耗了过多的CAT,细胞受到激发,刺激自身产生较多的番茄红素以猝灭过多的氧自由基,保证细胞能够正常渡过不利时期。但是,在更多氧自由基生成,以致菌体CAT合成和次级产物形成也不能猝灭这些过多的自由基时,菌体就趋向自溶甚至凋亡。 (5)外源H_2O_2胁迫对CAT合成的影响主要取决于H_2O_2胁迫的程度(H_2O_2浓度)和胁迫方式(瞬时刺激或者持续刺激)。一般来说,低浓度的H_2O_2能够诱导CAT合成,合成的CAT立即分解H_2O_2,以消除H_2O_2对细胞的继续毒害作用,同时提高细胞对氧自由基的抵抗能力。但当H_2O_2浓度超过CAT的分解能力或CAT来不及分解时,H_2O_2就在Fenton和Harber-Weiss反应下生成OH·,由其氧化蛋白质、核酸等生物大分子,造成细胞生物功能丧失,影响抗氧化物酶的合成,最终导致细胞死亡。


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