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《北京工商大学》 2016年
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产尿嘧啶核苷酸的酿酒酵母重组菌的代谢调控研究

张凯丽  
【摘要】:尿嘧啶核苷酸(UMP)处于嘧啶核苷酸生物合成的节点位置,作为重要的食品添加剂和医药中间体广泛用于合成寡聚糖和抗癌药物,市场需求很大,但是由于其生产纯化工艺复杂而相对短缺。酿酒酵母以其生长繁殖快、产物安全无毒、基因背景清晰等优势在生产UMP方面显示出巨大的潜力。本文为了解析酿酒酵母重组菌在产尿苷酸的代谢过程中的流量分配及随各种条件的变化情况,首先利用单因素和响应面方法优化了酿酒酵母p YX212-URA5/YPH499(ΔURA6)以葡萄糖为唯一碳源的合成培养基成分和发酵条件,使酿酒酵母生物量达到最大;其次,利用Matlab和Cell Net Analyzer构建了酿酒酵母重组菌产UMP的代谢模型,通过测定分批发酵拟稳态代谢物的积累或消耗速率,得到实际发酵代谢流分布,并与线性规划法求得的UMP最大化时的理想代谢流分布进行对比,以发现潜在的调控机制。再次,利用已构建的网络模型对比分析不同溶氧和初始葡萄糖浓度条件下UMP生物合成的代谢流分布,比较代谢过程中关键节点的流量差异。最后,利用代谢流分析结果进行调控,分别采用添加糖酵解抑制剂和基因过表达的方法,并验证其是否有效。经过优化试验,酿酒酵母的菌体浓度OD600nm达到26.8,较优化前提高了5.2倍,是后续代谢流分析试验顺利进行的生物量基础。通过代谢流分析可得出结论如下:1.酿酒酵母分批发酵拟稳态时有98.32%的碳流进入糖酵解途径(EMP),1.22%的碳流进入磷酸戊糖途径(HMP),UMP的产率为理论最大产率的0.62%。理想代谢流中,UMP最大化时EMP和HMP的流量比例接近2:1。与理想流分布相比,适当控制溶氧、提高HMP的流量,降低三羧酸循环(TCA)的流量有利于提高合成UMP的流量,另外,抑制副产物如有机酸等的合成能有效减少碳源的浪费。2.分析不同溶氧的代谢流分布得知,极低溶氧时进入HMP的流量提高约20%,但HMP的流量中只有约25%用于UMP合成;厌氧条件下最大约38%的碳流合成乙醇造成浪费。溶氧为1%时合成UMP的流量最高,高于厌氧发酵,与ATP的合成有关。代谢网络中,丙酮酸为柔性节点,6-磷酸葡萄糖、草酰乙酸及α-酮戊二酸均为刚性节点。节点分析显示,抑制乙醇脱氢酶的活性可间接促进UMP从头合成所需氨基酸的合成,但低溶氧时不显著,需补充适量UMP前体物质乳清酸;提高6-磷酸葡萄糖进入HMP的关键酶活性可以同时提高谷氨酸、天冬氨酸及5-磷酸核糖的合成,利于UMP合成。3.分析不同初始葡萄糖浓度的代谢流分布可知,葡萄糖浓度低于40g/L时,EMP和HMP的流量分布差别不大;葡萄糖浓度高于40g/L时,HMP的流量降低约30%,进入HMP的流量中仅有约20%用于合成UMP,所以需抑制HMP非氧化途径。葡萄糖浓度为40g/L时,由于天冬氨酸和谷氨酸的流量略高,基于NADPH消耗略多,促进碳流合成UMP。代谢网络中,各关键节点在不同葡萄糖浓度时流量变化均不显著,均为刚性节点。根据代谢流分析结果进行调控,结果显示发酵48h添加甲苯0.5%(v/v),糖酵解抑制剂氟化钠0.18mg/L,反应30h后UMP合成量最大约55mg/L,提高57%。另外,过表达6-磷酸葡萄糖脱氢酶(G6PDH)基因zwf1,转化后G6PDH酶活力提高1.2倍,且转化株UMP产量为80.59mg/L,较转化前提高42%。
【学位授予单位】:北京工商大学
【学位级别】:硕士
【学位授予年份】:2016
【分类号】:TQ926

【参考文献】
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