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《北京工商大学》 2016年
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产尿嘧啶核苷酸的酿酒酵母重组菌的代谢调控研究

张凯丽  
【摘要】:尿嘧啶核苷酸(UMP)处于嘧啶核苷酸生物合成的节点位置,作为重要的食品添加剂和医药中间体广泛用于合成寡聚糖和抗癌药物,市场需求很大,但是由于其生产纯化工艺复杂而相对短缺。酿酒酵母以其生长繁殖快、产物安全无毒、基因背景清晰等优势在生产UMP方面显示出巨大的潜力。本文为了解析酿酒酵母重组菌在产尿苷酸的代谢过程中的流量分配及随各种条件的变化情况,首先利用单因素和响应面方法优化了酿酒酵母p YX212-URA5/YPH499(ΔURA6)以葡萄糖为唯一碳源的合成培养基成分和发酵条件,使酿酒酵母生物量达到最大;其次,利用Matlab和Cell Net Analyzer构建了酿酒酵母重组菌产UMP的代谢模型,通过测定分批发酵拟稳态代谢物的积累或消耗速率,得到实际发酵代谢流分布,并与线性规划法求得的UMP最大化时的理想代谢流分布进行对比,以发现潜在的调控机制。再次,利用已构建的网络模型对比分析不同溶氧和初始葡萄糖浓度条件下UMP生物合成的代谢流分布,比较代谢过程中关键节点的流量差异。最后,利用代谢流分析结果进行调控,分别采用添加糖酵解抑制剂和基因过表达的方法,并验证其是否有效。经过优化试验,酿酒酵母的菌体浓度OD600nm达到26.8,较优化前提高了5.2倍,是后续代谢流分析试验顺利进行的生物量基础。通过代谢流分析可得出结论如下:1.酿酒酵母分批发酵拟稳态时有98.32%的碳流进入糖酵解途径(EMP),1.22%的碳流进入磷酸戊糖途径(HMP),UMP的产率为理论最大产率的0.62%。理想代谢流中,UMP最大化时EMP和HMP的流量比例接近2:1。与理想流分布相比,适当控制溶氧、提高HMP的流量,降低三羧酸循环(TCA)的流量有利于提高合成UMP的流量,另外,抑制副产物如有机酸等的合成能有效减少碳源的浪费。2.分析不同溶氧的代谢流分布得知,极低溶氧时进入HMP的流量提高约20%,但HMP的流量中只有约25%用于UMP合成;厌氧条件下最大约38%的碳流合成乙醇造成浪费。溶氧为1%时合成UMP的流量最高,高于厌氧发酵,与ATP的合成有关。代谢网络中,丙酮酸为柔性节点,6-磷酸葡萄糖、草酰乙酸及α-酮戊二酸均为刚性节点。节点分析显示,抑制乙醇脱氢酶的活性可间接促进UMP从头合成所需氨基酸的合成,但低溶氧时不显著,需补充适量UMP前体物质乳清酸;提高6-磷酸葡萄糖进入HMP的关键酶活性可以同时提高谷氨酸、天冬氨酸及5-磷酸核糖的合成,利于UMP合成。3.分析不同初始葡萄糖浓度的代谢流分布可知,葡萄糖浓度低于40g/L时,EMP和HMP的流量分布差别不大;葡萄糖浓度高于40g/L时,HMP的流量降低约30%,进入HMP的流量中仅有约20%用于合成UMP,所以需抑制HMP非氧化途径。葡萄糖浓度为40g/L时,由于天冬氨酸和谷氨酸的流量略高,基于NADPH消耗略多,促进碳流合成UMP。代谢网络中,各关键节点在不同葡萄糖浓度时流量变化均不显著,均为刚性节点。根据代谢流分析结果进行调控,结果显示发酵48h添加甲苯0.5%(v/v),糖酵解抑制剂氟化钠0.18mg/L,反应30h后UMP合成量最大约55mg/L,提高57%。另外,过表达6-磷酸葡萄糖脱氢酶(G6PDH)基因zwf1,转化后G6PDH酶活力提高1.2倍,且转化株UMP产量为80.59mg/L,较转化前提高42%。
【关键词】:酿酒酵母重组菌 尿苷酸 代谢流分析 基因过表达
【学位授予单位】:北京工商大学
【学位级别】:硕士
【学位授予年份】:2016
【分类号】:TQ926
【目录】:
  • 摘要4-6
  • Abstract6-13
  • 第1章 绪论13-21
  • 1.1 尿苷酸的生化性质及用途13-14
  • 1.1.1 核苷酸的分类及应用13
  • 1.1.2 尿苷酸的理化性质13-14
  • 1.1.3 尿苷酸的应用14
  • 1.2 尿苷酸的生产方法及研究现状14-16
  • 1.2.1 化学合成法14
  • 1.2.2 水解核酸法14-15
  • 1.2.3 微生物发酵法15-16
  • 1.3 尿苷酸的合成途径和代谢调节16-18
  • 1.3.1 尿苷酸的从头合成途径16
  • 1.3.2 尿苷酸合成的补救途径16-17
  • 1.3.3 尿苷酸的合成调节17-18
  • 1.4 代谢流分析(MFA)18-19
  • 1.4.1 代谢流分析概述18
  • 1.4.2 基于“拟稳态”假设的代谢网络计量模型研究理论18-19
  • 1.4.3 代谢流分析的应用19
  • 1.5 研究目的与内容19-21
  • 第2章 酿酒酵母培养基成分及培养条件优化21-35
  • 2.1 材料与仪器21-23
  • 2.1.1 试验仪器21
  • 2.1.2 试剂与药品21-22
  • 2.1.3 菌株22-23
  • 2.1.4 初始培养基23
  • 2.2 试验方法23-25
  • 2.2.1 比浊法测定酵母浓度23-24
  • 2.2.2 生长曲线的绘制24
  • 2.2.3 单因素优化培养基成分24
  • 2.2.4 响应面优化培养基成分24-25
  • 2.2.5 单因素优化发酵条件25
  • 2.3 试验结果与分析25-33
  • 2.3.1 初始合成培养基中生长曲线的绘制25
  • 2.3.2 单因素优化培养基成分结果25-28
  • 2.3.3 响应面优化培养基成分结果28-32
  • 2.3.4 单因素优化发酵条件结果32-33
  • 2.3.5 最优条件下酿酒酵母生长曲线绘制33
  • 2.4 小结33-35
  • 第3章 酿酒酵母重组菌产尿苷酸的实际与理想代谢流对比35-50
  • 3.1 材料与仪器35-36
  • 3.1.1 试验仪器35
  • 3.1.2 试剂与药品35
  • 3.1.3 菌株与培养基35-36
  • 3.2 试验方法36-39
  • 3.2.1 分批发酵培养36
  • 3.2.2 发酵液中代谢物测定36
  • 3.2.3 尿苷酸代谢模型构建36-39
  • 3.3 试验结果与分析39-49
  • 3.3.1 代谢物测定谱图及标准曲线39-42
  • 3.3.2 稳定期代谢物测定曲线42-45
  • 3.3.3 UMP生物合成理想代谢流分布45
  • 3.3.4 UMP生物合成实际代谢流分布45-48
  • 3.3.5 UMP生物合成关键节点分析48-49
  • 3.4 结论49-50
  • 第4章 不同溶氧对酿酒酵母产尿苷酸的代谢流分布的影响50-61
  • 4.1 材料与仪器50
  • 4.1.1 试验仪器50
  • 4.1.2 试剂与药品50
  • 4.1.3 菌株与培养基50
  • 4.2 试验方法50-51
  • 4.2.1 代谢物的检测50
  • 4.2.2 尿苷酸代谢模型构建50
  • 4.2.3 不同溶氧条件下发酵试验50-51
  • 4.3 试验结果与分析51-59
  • 4.3.1 溶氧曲线的绘制51
  • 4.3.2 不同溶氧条件下代谢物积累/消耗速率比较51-56
  • 4.3.3 不同溶氧对代谢流分布的影响56-57
  • 4.3.4 关键节点分析57-59
  • 4.4 小结59-61
  • 第5章 不同葡萄糖浓度对酿酒酵母产尿苷酸的代谢流分布的影响61-70
  • 5.1 材料与仪器61
  • 5.1.1 试验仪器61
  • 5.1.2 试剂与药品61
  • 5.1.3 菌株与培养基61
  • 5.2 试验方法61-62
  • 5.2.1 代谢物的检测61
  • 5.2.2 尿苷酸代谢模型构建61
  • 5.2.3 不同葡萄糖浓度条件下的发酵实验61-62
  • 5.3 试验结果与分析62-69
  • 5.3.1 生长曲线的绘制62
  • 5.3.2 不同葡萄糖浓度条件下代谢物积累/消耗速率比较62-67
  • 5.3.3 不同葡萄糖浓度对代谢流分布的影响67-69
  • 5.4 小结69-70
  • 第6章 酿酒酵母重组菌产尿苷酸的代谢调控70-86
  • 6.1 材料与仪器70-72
  • 6.1.1 试验仪器70-71
  • 6.1.2 菌株与质粒71
  • 6.1.3 试剂与工具酶71-72
  • 6.1.4 培养基72
  • 6.2 试验方法72-76
  • 6.2.1 甲苯、吐温80及二甲基亚砜优化试验72
  • 6.2.2 碘乙酸、氟化钠调控试验72
  • 6.2.3 6-磷酸葡萄糖脱氢酶基因zwf1克隆72-73
  • 6.2.4 重组质粒pYES-pgk-zwf1的构建73-74
  • 6.2.5 重组质粒转化大肠杆菌74
  • 6.2.6 重组质粒转化酿酒酵母74-75
  • 6.2.7 G6PDH活性测定75
  • 6.2.8 重组菌pYX212-URA5/YPH499(ΔURA6)-zwf1尿苷酸产量测定75-76
  • 6.3 试验结果与分析76-84
  • 6.3.1 增大细胞膜通透性优化结果分析76-78
  • 6.3.2 糖酵解抑制剂调控结果分析78-81
  • 6.3.3 zwf1基因克隆81-82
  • 6.3.4 重组质粒构建及酶切验证82
  • 6.3.5 重组质粒转化酿酒酵母及阳性转化子的筛选82-83
  • 6.3.6 比较转化前后酿酒酵母83-84
  • 6.4 小结84-86
  • 第7章 结论与展望86-88
  • 7.1 结论86-87
  • 7.2 展望87-88
  • 参考文献88-93
  • 附录93-95
  • 在学期间发表的学术论文与研究成果95-96
  • 致谢96

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