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拟南芥WRKY45转录因子参与响应低磷胁迫的实验证据

王慧  
【摘要】:磷是植物生长发育必需的大量元素之一,参与植物体内的能量代谢,生物大分子的合成等过程。土壤中可供植株吸收利用的无机磷浓度为10μM左右,而植物细胞内磷浓度一般在5mM-20mM之间。长期处于缺磷状态的植物进化出了一系列的功能形态来适应这种环境,如根构型的改变、磷酸酶的分泌、诱导磷转运体(PHT1;1和PHT1;4)的表达等。 WRKY蛋白是植物特有的一类转录因子,参与响应各种生物胁迫和非生物胁迫。实验室前期对拟南芥WRKY家族所有成员进行低磷诱导转录水平检测,发现若干WRKY基因受低磷诱导表达。本论文选取了受低磷明显诱导表达的WRKY45。亚细胞定位结果显示WRKY45特异定位在细胞核,分析氨基酸序列发现WRKY45具有WRKY家族经典的结构域(WRKYGQK)。Real-time PCR结果显示WRKY45主要在幼苗期根部表达,低磷处理后WRKY45在根部的表达进一步增强。磷吸收实验以及磷含量测定发现,35S:WRKY45材料磷吸收速率和磷含量都高于野生型材料,WRKY45RNAi材料中磷吸收速率和磷含量低于野生型材料。这些结果显示WRKY45参与植物响应低磷胁迫。 Real-time PCR结果显示磷转运体PHT1;1的转录水平在35S:WRKY45材料中上调;GUS染色结果显示WRKY45RNAi/ProPHT1;1:GUS的遗传材料染色弱于ProPHT1;1:GUS材料,而35S:WRKY45/ProPHT1;1:GUS的遗传材料染色结果强于ProPHT1;1:GUS材料;烟草瞬时转化体系也发现在烟草体系中WRKY45上调PHT1;1的表达,这些结果说明WRKY45正调控PHT1;1的表达。染色质免疫共沉淀(ChIP)实验结果证明WRKY45在植物体内可以直接结合到PHT1;1启动子上;凝胶阻滞(EMSA)实验证明WRKY45也能在体外直接结合到PHT1;1启动子上,ChIP实验和EMSA实验结果说明WRKY45直接正向调控PHT1;1的表达。 进一步的研究发现,ProPHT1;1:GUS的GUS染色部位与WRKY45的GUS染色部位非常相似,PHT1;1主要在根部表达,低磷诱导进一步增强。Super:PHT1;1材料磷含量与磷吸收速率都明显高于野生型和35S:WRKY45材料,phtl;l突变体磷含量与磷吸收速率低于野生型材料。砷酸盐的化学结构与磷酸盐类似,通过磷转运体PHT1;1进入植物体内对植物造成毒害。砷酸盐毒害实验结果显示,35S:WRKY45材料与Super:PHT1;1材料比野生型材料对砷酸盐敏感,说明35S:WRKY45材料吸收磷的能力增强是由于体内PHT1;1的表达量上调引起的。 35S:WRKY45/pht1;1遗传材料磷吸收和砷酸盐毒害实验都显示出与phtl;1突变体类似的结果。证明了PHT1;1是WRKY45的遗传上位基因。 综上所述,本论文分别从生理、生化实验以及遗传学实验证明了WRKY45通过结合到PHT1;1启动子上的顺式作用元件W-box,直接正向调控PHT1;1的表达,为植物响应低磷胁迫提供了新的证据。


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