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《中国农业大学》 2014年
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ATF6在内质网应激引起的HepG2细胞自噬与凋亡中作用机制的研究

王丛丛  
【摘要】:活化转录因子6(Activating Transcription Factor6, ATF6)为内质网上的一种感受蛋白,是内质网应激引起的细胞凋亡和自噬途径中的一个重要的调节因子。尽管随着研究的深入对其调控机制已经取得了一些进展,但其在内质网应激引起的凋亡和自噬中的具体调控机制尤其是肿瘤细胞中的作用机制还不是很清楚。因此,本研究以人肝癌HepG2细胞为研究对象,在内质网应激条件下,探讨ATF6在细胞凋亡和自噬中的作用以及由其介导的信号传导途径,为进一步阐明ATF6在凋亡与自噬中的作用机制提供实验依据。同时,为肿瘤治疗研究提供新的作用靶点。 本研究以不同浓度毒胡萝卜素(TG)干预HepG2细胞24h或48h,分别用MTT法、Hochest33342染色和罗丹明123检测细胞存活率、凋亡形态和线粒体膜电位的变化,用流式细胞术检测细胞凋亡的变化。用不同浓度的TG作用细胞24h,多功能酶标仪检测三种Caspases酶活性的变化。采用Caspase3抑制剂AC-DEVD-CHO和Caspase9抑制剂Z-LEDH-FMK分别处理细胞后,用1μM的TG染毒HepG2细胞48h,流式细胞术检测细胞凋亡率的改变。同时应用Western blot检测凋亡相关蛋白的表达情况。结果表明,TG显著抑制了细胞的增殖且呈现明显的剂量和时间相关性。TG作用后,HepG2细胞呈典型的凋亡细胞形态;线粒体膜电位显著下降,且呈浓度依赖性;细胞凋亡率均明显升高,且在一定范围内具有浓度和时间依赖性;Caspase3和Caspase9的酶活性显著增加,且呈浓度依赖性,而Caspase8的酶活性无明显变化。Caspase3和Caspase9活性被抑制后,细胞凋亡率显著下降。凋亡相关蛋白Caspase3、Caspase9均发生了剪切表达量下降,抑凋亡蛋白Bcl-2表达减少,促凋亡蛋白Bax和Cyt C表达增加,同时内质网应激相关蛋白Caspase12表达量也显著上升,且在一定范围内呈浓度和时间依赖性;而死亡受体相关蛋白Caspase8、Fas和FADD的表达量无显著变化。以上结果表明,由毒胡萝卜素诱导的内质网应激反应能够抑制人肝癌HepG2细胞的存活和增殖,并进一步诱导其发生凋亡,其凋亡途径可能与线粒体途径有关。 为了探讨毒胡萝卜素引起的内质网应激对人肝癌HepG2细胞自噬的影响及其调控机制。本研究经不同浓度TG作用24h和1μM的TG分别作用不同时间,采用MDC染色,荧光显微镜观察自噬囊泡,流式细胞术检测其自噬发生率。pEGFP-LC3质粒瞬时转染HepG2细胞,TG处理24h后,荧光显微镜检测绿色荧光蛋白的点状聚集程度。Western blot检测内质网应激和自噬相关蛋白的表达情况。结果显示,TG作用后,在细胞质可见明显的点状MDC阳性荧光颗粒聚积;自噬发生率在一定的范围内呈时间和浓度依赖性。GFP-LC3在TG作用组细胞中出现明显点状聚集,其数量呈时间依赖性增加。内质网应激相关蛋白Bip、p50ATF6、IRE-1和CHOP表达升高,自噬相关蛋白LC3Ⅱ/Ⅰ表达量比值呈浓度和时间依赖性增加,Beclinl和DAPK1的蛋白表达水平随处理时间的延长和浓度的增加,表达量也逐渐升高,自噬活性标志蛋白p62的表达则明显下降。由此说明毒胡萝卜素诱导的内质网应激反应能够诱导人肝癌HepG2细胞发生自噬,且可能与]DAPK1有关。 为了进一步探讨内质网应激诱导的自噬和凋亡之间的关系,我们采用自噬抑制剂3-MA抑制细胞的自噬水平,流式细胞术检测细胞凋亡率的变化,同时通过Western blot检测凋亡相关蛋白的变化。结果显示,3-MA和TG联合应用后细胞凋亡率显著升高,凋亡相关蛋白Bcl-2的表达量也下降,促凋亡蛋白Bax的表达则显著增加。以上结果表明,抑制自噬可以促进内质网应激诱导的细胞凋亡。 为了明确ATF6在内质网应激引起的HepG2细胞凋亡和自噬中的作用。我们将高表达的ATF6瞬时转染HepG2细胞,并用TG引起内质网应激。用荧光显微镜观察凋亡和白噬形态的变化、流式细胞仪检测细胞的凋亡率、自噬发生率和线粒体膜电势的变化、透射电子显微镜观察细胞自噬泡的形成情况、多功能酶标仪检测酶活性的变化、QRT-PCR法和Western blot检测凋亡和自噬相关蛋白的变化。结果表明,ATF6高表达后由内质网应激引起的细胞凋亡形态的变化更加明显;细胞质内点状MDC阳性荧光颗粒聚积显著增加且绿色荧光明显增强;细胞内出现大量的自噬空泡并在泡内可见明显的细胞内容物;细胞凋亡率和自噬发生率也显著增加。另外,Caspase3和Caspase9的酶活性也显著升高。线粒体途径相关蛋白Caspase9、CytC及Bax的表达量均升高,Bcl-2的表达则显著降低,而死亡受体途径相关蛋白则无显著变化;自噬相关蛋白LC3II/LC3I的比率则明显升高,Beclinl和DAPK1的表达水平都显著增加,p62表达量则显著下降。这说明,ATF6的高表达可以促进内质网应激引起的凋亡和自噬,其可能是通过下调Bcl-2/Bax的比例来介导线粒体通路来调控的细胞凋亡,而且对自噬的调控可能是通过激活DAPKl-Beclinl这一途径来完成的。 为了进一步探讨ATF6在内质网应激引起的凋亡和自噬中具体的分子作用机制。将高表达的ATF6瞬时转染HepG2细胞后,在内质网应激条件下,通过iTRAQ技术对其差异表达的蛋白进行筛选,并运用Gene Ontology和KEGG数据库等进行信息学分析;应用QRT-PCR和Western blot方法对与凋亡和自噬有关的mRNA和蛋白水平进行检测,验证iTRAQ筛选差异蛋白结果;并分别用Blebbistatin、SB203580和Dynasore作为MYH9、HSPB1和Dynamin Ⅱ的抑制剂,Western blot检测自噬和凋亡相关蛋白的变化。iTRAQ数据显示,共筛选到差异蛋白106个,其中有52种蛋白表达上调,54种蛋白表达下调。生物信息学分析表明,在这些差异蛋白中有许多与肿瘤的发生、发展有关;其中有24种蛋白与凋亡和自噬有关。验证实验表明,我们所挑选的基因和蛋白的变化趋势与iTRAQ结果中差异蛋白的变化趋势基本相一致。应用Blebbistatin和Dynasore并联合ATF6高表达后,凋亡相关蛋白Bcl-2的表达均升高,Bax表达量则显著下降;自噬相关蛋白LC3Ⅱ和Beclin1的表达量显著降低,p62的表达量则上升。应用SB203580并联合ATF6高表达后,Bcl-2、LC3Ⅱ和Beclinl的表达量明显下降,Bax和p62的表达量则显著上升。以上结果表明,在内质网应激条件下,MYH9、HSPB1和Dynamin Ⅱ三个蛋白可能参与了ATF6介导的细胞凋亡和自噬过程。 综上所述,内质网应激可以诱导人肝癌HepG2细胞发生细胞凋亡和自噬。ATF6能够促进内质网应激引起的凋亡和自噬,其调控凋亡的作用机制与线粒体途径有关,而DAPK1-Beclinl这一通路的激活参与了其调控自噬的过程。MYH9、HSPB1和Dynamin Ⅱ三个蛋白均在ATF6介导的细胞凋亡和自噬过程中发挥了重要的作用,可作为研究ATF6调节凋亡和自噬作用机制的分子靶点。
【学位授予单位】:中国农业大学
【学位级别】:博士
【学位授予年份】:2014
【分类号】:R735.7;R730.54

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【参考文献】
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