收藏本站
《中国农业大学》 2015年
收藏 | 手机打开
二维码
手机客户端打开本文

黄曲霉毒素降解酶基因克隆表达和降解剂在肉鸡中的应用研究

范彧  
【摘要】:试验一目的是抽样调查北京地区饲料及饲料原料中的黄曲霉毒素(aflatoxin,AF)污染状况。调查结果显示,北京地区15个猪场和6个养鸡场的231份样品(玉米、麸皮、饼粕类、DDGS和全价配合饲料)中的AF污染普遍存在;黄曲霉毒素B1(AFB1)在玉米、麸皮、饼粕类、DDGS和全价配合饲料中的检出率分别达到45.8%、52.2%、40.9%、86.5%和72.0%,超标率分别为8.3%、0.0%、22.7%、8.7%和 4.0%。其中,AFB1的平均含量分别为 5.48、0.25、87.15、10.52 和 2.14 μg/kg;同时,调研结果显示,各类饲料均受AFB1污染,玉米、饼粕类、DDGS和部分配合饲料中AFB1平均含量较高,超标率也较高;麸皮受AFB1轻度程度的污染。试验二目的是对产自橙红色粘球菌(Myxococcus fulvus)的黄曲霉毒素降解酶(Myxobacteria aflatoxin degradation enzyme,MADE)进行基因克隆。本试验通过前期研究获得的肽段氨基酸序列设计简并引物,通过简并PCR扩增,得到中间部分片段,片段长度为865 bp;并根据测序结果设计特异引物,再应用cDNA末端快速扩增(Rapid amplification of cDNA ends,RACE)技术,结合巢式PCR方法,分别扩增其5'端和3'端未知的序列。通过比对中间片段、5'-RACE和3'-RACE产物,找到重叠区域并拼接。最终以基因组DNA为模板,进行PCR扩增,得到一条1 659 bp大小的序列,通过Blast比对,与Myxococcus fulvus(124B02)的相似性为98%。推导出此片段所编码的氨基酸序列,与其余特征肽段的已知氨基酸序列比对,相似度为98%以上。经过生物信息学分析预测,MADE蛋白分子量为57.0 kDa,理论等电点为4.74,N端含有一段信号肽,为分泌型蛋白,预测其氨基酸序列有36个磷酸化位点和1个糖基化位点。试验三目的是将降解酶MADE基因在大肠杆菌中进行外源表达。本研究首先将MADE基因和大肠杆菌表达载体pET30a经BamHI和Sal I双酶切后,体外连接,构建了重组原核表达载体pET30a-made,然后将其转化入大肠杆菌E.coliBL21(DE3)中;经过菌落PCR、酶切鉴定和序列测定,验证降解酶基因成功转入大肠杆菌BL21中。通过加入IPTG诱导,重组蛋白被成功表达,但主要以包涵体形式存在。1L重组大肠杆菌工程菌发酵能获得1000 mg rMADE蛋白,降解AFB1的总活性为100 000 U,rMADE的酶比活为100 U/mg。试验四目的是将降解酶MADE基因在毕赤酵母中进行外源表达,并对表达条件进行优化。本研究将优化合成的MADE基因和毕赤酵母表达载体pPICZαA经EcoR I和NotI双酶切后,体外连接构建了重组真核表达载体pPICZαA-made-opt,然后经限制性内切酶Sac I线性化后电转化至毕赤酵母GS115感受态细胞;经过PCR和测序鉴定,证明降解酶基因被成功转入毕赤酵母GS115中。加入甲醇诱导表达,最佳诱导表达条件为:BMMY培养基pH值为4.0,甲醇浓度为1.5%,培养温度28℃,培养时间5 d。1 L重组毕赤酵母工程菌菌液能获得2 000 mg rMADE蛋白,降解AFB1的总活性为300 000 U,rMADE的酶比活为150 U/mg。试验五目的是研究枯草芽孢杆菌ANSB060制成的黄曲霉毒素生物降解剂,对采食AF污染日粮肉公鸡机体抗氧化性能、组织器官形态及组织中黄曲霉毒素残留量的影响。试验共选用360只1日龄罗斯308肉公鸡,随机分为6个处理,每个处理6个重复,每个重复10只鸡。C0组(正对照组)饲喂正常玉米豆粕型日粮,C1.0组是在C0的基础上添加1.0 kg/t的黄曲霉毒素生物降解剂(枯草芽孢杆菌ANSB060活菌数为3×109 CFU/g),MO组(负对照组)是用21%的霉变花生粕等量替代CO中的正常花生粕,M0.5、M1.0和M2.0组是在MO的基础上分别添加0.5、1.0和2.0 kg/t的降解剂。试验期42天。结果表明,与对照组相比,黄曲霉毒素污染日粮可导致肉鸡血清中谷草转氨酶(AST)活性显著升高,谷胱甘肽过氧化物酶(GSH-Px)活性显著降低,血清和肝脏中丙二醛(MDA)含量显著升高(P0.05);M0组肝脏肿大苍白,出现胆管增生、肝细胞空泡变性以及肝细胞和汇管区淋巴细胞浸润现象。在霉变日粮中添加降解剂使这些症状明显减轻,以添加剂量为2.0 kg/t时效果最明显。结果还表明降解剂的添加可使肉鸡十二指肠和肝脏中黄曲霉毒素的残留量显著降低。
【学位授予单位】:中国农业大学
【学位级别】:博士
【学位授予年份】:2015
【分类号】:S831.5

【参考文献】
中国期刊全文数据库 前10条
1 王燕;张美丽;毛勇;李胜;赵毅;李飞;邓媛;杨汉卿;张志敏;;黄曲霉毒素B1降解菌的分离鉴定及培养条件优化[J];河南农业科学;2015年04期
2 张盼;李培武;万霞;江木兰;龚阳敏;胡传炯;丁小霞;张银波;;枯草芽孢杆菌Natto3的筛选及其降解黄曲霉毒素B_1的初步研究[J];中国油料作物学报;2015年02期
3 刘凤芝;孙合美;廉新慧;李春凤;丛秋霞;张甜甜;尹训兰;谷巍;;2014年饲料及饲料原料中黄曲霉毒素B_1污染状况的分析[J];广东饲料;2015年03期
4 朱鹏飞;刘文卫;凌霞;周闰;蒋瑜宏;姚誉阳;;柱前衍生-高效液相色谱荧光法测定粮谷类食物中黄曲霉毒素B_1、B_2、G_1、G_2[J];中国卫生检验杂志;2015年06期
5 季海霞;苏永腾;;2014年饲料霉菌毒素分析报告[J];广东饲料;2015年02期
6 孙玲玉;李超;郝海玉;柴同杰;;泰山枯草芽孢杆菌的分离鉴定及其对黄曲霉毒素B_1的降解研究[J];中国畜牧兽医;2014年08期
7 肖波;迟晓艳;屈慧鸽;张莉;王晓洁;;双软件多参数联合对草鱼同义密码子偏性的分析[J];中国农学通报;2014年17期
8 计成;;霉菌毒素对家禽的危害及降解技术[J];中国家禽;2014年02期
9 孙翠萍;万宇平;王效东;马长旺;钱宏光;;黄曲霉毒素M1胶体金快速检测试纸条的研制[J];吉林畜牧兽医;2013年01期
10 王会娟;刘阳;邢福国;;高产漆酶平菇的筛选及其在降解黄曲霉毒素B_1中的应用[J];核农学报;2012年07期
中国博士学位论文全文数据库 前3条
1 李笑樱;降解呕吐毒素德沃斯氏菌的饲用安全性和有效性评价[D];中国农业大学;2015年
2 雷元培;ANSB01G菌对玉米赤霉烯酮的降解机制及其动物试验效果研究[D];中国农业大学;2014年
3 左瑞雨;黄曲霉毒素B_1的生物降解及其在肉鸡生产中的应用研究[D];河南农业大学;2012年
中国硕士学位论文全文数据库 前4条
1 李文明;黄曲霉毒素B_1生物降解产物的分离鉴定及其致突变性研究[D];南昌大学;2013年
2 陈瑾;黄曲霉毒素B_1对雏鸡免疫器官影响的研究[D];四川农业大学;2013年
3 王勇;黄曲霉毒素降解酶对饲喂含AFB_1日粮肉仔鸡生长性能及健康的影响[D];河北农业大学;2010年
4 韩聪;家蚕OCIAD2基因的克隆表达及其定位研究[D];浙江理工大学;2010年
【共引文献】
中国期刊全文数据库 前10条
1 申杰;潘爱銮;皮劲松;吴艳;蒲跃进;张洪波;孙静;张昊;;肉鸡规模化地面平养垫料消毒去霉技术研究[J];湖北农业科学;2015年24期
2 薛昆鹏;郭会琴;余冲;汪超;蓝凯;赵岳星;;免疫亲和柱净化-高效液相色谱柱后光化学衍生-荧光检测器检测食品中黄曲霉毒素[J];食品安全质量检测学报;2015年12期
3 徐进栋;李玲;修华;朱连勤;朱风华;;2014年山东省饲料原料中黄曲霉毒素污染状况调查[J];中国家禽;2015年20期
4 陈复生;郝莉花;江连州;殷丽君;;酶技术制取植物油脂的研究进展[J];河南工业大学学报(自然科学版);2015年05期
5 黄帅;范彩云;程建波;;黄曲霉毒素的生物毒性及其在奶畜体内转移规律[J];动物营养学报;2015年10期
6 毕水莲;黄思敏;;免疫法快速检测食品中黄曲霉毒素的研究进展[J];食品安全质量检测学报;2015年09期
7 汪海平;褚玲娜;钦芳臣;陈沈宽;;家禽营养代谢疾病的探索与研究[J];畜牧与饲料科学;2015年08期
8 张玲玲;杨彩梅;张旭;刘金松;曾新福;;微生物降解黄曲霉毒素的研究进展[J];饲料博览;2015年07期
9 郭佳怡;陈洁;何润霞;关心;董双;龙淼;;呕吐毒素和其他B型单端孢霉烯族毒素对肠道影响研究进展[J];畜牧与兽医;2015年05期
10 陈曦;侯玉泽;蔡齐超;胡骁飞;邓瑞广;;黄曲霉毒素M1免疫学检测方法研究进展[J];中国免疫学杂志;2015年03期
中国博士学位论文全文数据库 前2条
1 田吉鹏;全株玉米青贮饲料中黄曲霉毒素积累规律及调控技术研究[D];中国农业大学;2017年
2 范彧;黄曲霉毒素降解酶基因克隆表达和降解剂在肉鸡中的应用研究[D];中国农业大学;2015年
中国硕士学位论文全文数据库 前10条
1 韩美玉;姜黄素对AFB1亚慢性中毒肉鸡免疫功能的影响[D];东北农业大学;2017年
2 段锦艳;基于线粒体基因的锈赤扁谷盗磷化氢抗性机理研究[D];南京财经大学;2017年
3 王芳;蒙脱石对采食含霉变花生粕饲粮的肉仔鸡生产性能及健康的影响[D];甘肃农业大学;2016年
4 于正强;黄曲霉毒素B_1致雏鸡中枢免疫器官细胞凋亡机理的研究[D];四川农业大学;2016年
5 李海利;不同替代比例的花生秧、玉米和豆粕对生长獭兔营养物质表观消化率的影响[D];河北农业大学;2015年
6 李瑞娟;黄芪多糖对AFB_1所致雏鸡肝及免疫功能损伤的缓解作用研究[D];河北农业大学;2015年
7 王大才;枯草芽孢杆菌制剂对饲喂含AFB_1发霉饲料黄河鲤鱼生理生化指标的影响[D];河南工业大学;2015年
8 张芳;真菌毒素臭氧降解及其他脱毒方法研究[D];江南大学;2014年
9 崔玉琦;降解黄曲霉毒素M1细菌菌株的研究[D];河北农业大学;2014年
10 崔捷;添加黄曲霉毒素降解酶对肉牛生产性能、胴体品质、血液指标和组织残留量的影响[D];河北农业大学;2013年
【二级参考文献】
中国期刊全文数据库 前10条
1 陈佳亮;刘晓文;张雅静;方晓航;;耐性细菌的分离鉴定及重金属污染修复初步研究[J];生态环境学报;2014年07期
2 刘利强;杨士玲;陈强;马丽;;30亿个/g甲基营养型芽孢杆菌可湿性粉剂防治黄瓜灰霉病田间药效试验[J];现代农业科技;2014年09期
3 周登博;井涛;谭昕;张锡炎;符良贤;高祝芬;黄霄;刘小玉;;6种基质拮抗菌发酵液对香蕉枯萎病及相关防御酶的影响[J];热带作物学报;2013年05期
4 谢刚;王松雪;张艳;;超高效液相色谱法快速检测粮食中黄曲霉毒素的含量[J];分析化学;2013年02期
5 陈冉;李培武;马飞;丁小霞;张文;张奇;;花生黄曲霉毒素污染臭氧脱毒技术研究[J];中国油料作物学报;2013年01期
6 杨文华;刘晓华;李文明;李海星;曹郁生;;施氏假单胞菌F4产黄曲霉毒素B_1降解酶条件的优化[J];食品科学;2013年09期
7 吴燕燕;张岩;李来好;杨贤庆;王晶;;甲基营养型芽孢杆菌抗菌肽对罗非鱼片保鲜效果的研究[J];食品工业科技;2013年02期
8 邱文倩;傅武胜;;柱后光化学衍生-高效液相色谱法测定食品中4种黄曲霉毒素方法研究[J];海峡预防医学杂志;2012年05期
9 ;Characterization of Synonymous Codon Usage Bias in the Pseudorabies Virus US1 Gene[J];Virologica Sinica;2012年05期
10 李超波;李文明;杨文华;李海星;刘晓华;曹郁生;;黄曲霉毒素B_1降解菌的分离鉴定及其降解特性[J];微生物学报;2012年09期
中国博士学位论文全文数据库 前3条
1 程波财;抑制镰刀菌及降解两种真菌毒素的益生菌筛选和机理研究[D];中南大学;2010年
2 苏军;镰刀菌毒素对猪的抗营养效应及其机制研究[D];四川农业大学;2008年
3 何成华;脱氧雪腐镰刀菌烯醇毒性和生物转化的研究[D];南京农业大学;2007年
中国硕士学位论文全文数据库 前3条
1 李超波;黄曲霉毒素B_1降解菌的分离鉴定及其降解特性[D];南昌大学;2012年
2 侯然然;酵母细胞壁中葡甘露聚糖的提取及其霉菌毒素吸附效果[D];中国农业科学院;2007年
3 施翠娥;黑曲霉离子束注入的生物学效应及其拮抗黄曲霉的研究[D];安徽农业大学;2004年
【相似文献】
中国期刊全文数据库 前10条
1 汪恩婷;邹振宇;杨皓;杨京;;应用高效液相色谱法检测食品中黄曲霉毒素[J];食品安全导刊;2018年36期
2 彭永敏;;食品中黄曲霉毒素的检测方法[J];食品安全导刊;2018年36期
3 曹长会;;临沂市煎饼类食品中黄曲霉毒素含量测定及分析[J];中国卫生检验杂志;2019年05期
4 陈勇;荣道兴;任利民;;黄曲霉毒素对家禽的危害与防控措施[J];阿坝科技;2012年02期
5 李区;;黄曲霉毒素分析方法进展[J];广西水产科技;2005年03期
6 王少军;于春娣;唐娟;程果;谢晓丽;杨庆利;;黄曲霉毒素生物脱毒法研究进展[J];食品研究与开发;2018年24期
7 诸晨;钱勇;;高效液相色谱-质谱联用法测定薏苡仁药材中黄曲霉毒素[J];食品安全质量检测学报;2019年05期
8 邢天一;;液相色谱串联质谱法检测食品中的黄曲霉毒素实践探讨[J];农民致富之友;2017年23期
9 马冠生;;黄曲霉和黄曲霉毒素真那么可怕吗[J];生命与灾害;2017年11期
10 马亚伟;;猪饲料中黄曲霉素毒素危害与检测[J];农技服务;2017年19期
中国重要会议论文全文数据库 前10条
1 乔宏兴;姜亚乐;王永芬;史洪涛;边传周;;黄曲霉毒素的危害及其脱毒方法研究进展[A];中国畜牧兽医学会动物微生态学分会第五届第十三次全国学术研讨会论文集[C];2018年
2 孙淑娟;曾于洋;江海洋;;中药中黄曲霉毒素检测方法研究进展[A];中国毒理学会兽医毒理学委员会与中国畜牧兽医学会兽医食品卫生学分会联合学术研讨会暨中国毒理学会兽医毒理学委员会第5次全国会员代表大会会议论文集[C];2017年
3 胡丽莎;谢春芳;姚冬生;刘大岭;;用等温滴定微量热技术对黄曲霉毒素氧化酶动力的研究[A];第八届中国酶工程学术研讨会论文集[C];2011年
4 黎玉凤;张赛;谢春芳;刘大岭;姚冬生;;黄曲霉毒素解毒酶体外分子定向进化(Ⅱ)[A];第八届中国酶工程学术研讨会论文集[C];2011年
5 施晓晨;安雅男;申凤鸽;于录;;黄曲霉毒素诱导巨噬细胞自噬机制的研究[A];中国畜牧兽医学会兽医药理毒理学分会第十一届会员代表大会暨第十三次学术讨论会与中国毒理学会兽医毒理专业委员会第五次学术研讨会论文集[C];2015年
6 王文龙;李成成;安立龙;;简述环境中黄曲霉毒素对蛋鸡产业潜在的生态和健康风险[A];中国畜牧兽医学会2014年学术年会论文集[C];2014年
7 孟庆利;;黄曲霉毒素的检测及控制[A];《2010中国猪业进展》论文集[C];2010年
8 翁善钢;Kaori Nishide;;亚太地区的黄曲霉毒素[A];第十二届(2014)中国猪业发展大会论文集[C];2014年
9 陈建民;张雪辉;杨美华;金钺;;中药中黄曲霉毒素检测概况[A];第八届全国中药和天然药物学术研讨会与第五届全国药用植物和植物药学学术研讨会论文集[C];2005年
10 马静;朱惠莲;唐志红;凌文华;;尿粪黄曲霉毒素排泄及生物干预[A];中国环境诱变剂学会抗诱变剂和抗癌剂专业委员会第三次全国学术会议、中国毒理学会生化与分子毒理专业委员会第五届学术交流会、贵州省环境诱变剂学会成立大会暨首届学术交流会论文集[C];2004年
中国重要报纸全文数据库 前10条
1 本报记者 马爱平;黄曲霉毒素超标“致命”怎么破?[N];科技日报;2018年
2 国家食品安全风险评估中心副研究员 钟凯;普洱茶中携带黄曲霉会不会产生毒素?[N];中国医药报;2017年
3 食品与营养信息交流中心副主任 钟凯;花生酱含黄曲霉 吃了会怎样[N];健康报;2017年
4 科信食品与营养信息交流中心副主任 中华预防医学会健康传播分会常务委员 钟凯;农家花生油既便宜又放心?[N];保健时报;2017年
5 美国普度大学农业与生物工程系博士 云无心;检测出黄曲霉毒素 普洱茶还能喝吗[N];保健时报;2017年
6 记者 季征;云南农大研究表明普洱茶不含黄曲霉毒素[N];云南日报;2017年
7 本报记者 付丽丽 马波;茶照喝 牙照刷[N];科技日报;2017年
8 本报记者 陈海波;喝普洱茶,真的会致癌吗[N];光明日报;2017年
9 南方日报见习记者 郜小平;普洱茶致癌?谣言![N];南方日报;2017年
10 记者 杨艳萍;普洱茶中不含黄曲霉毒素[N];昆明日报;2017年
中国博士学位论文全文数据库 前10条
1 范彧;黄曲霉毒素降解酶基因克隆表达和降解剂在肉鸡中的应用研究[D];中国农业大学;2015年
2 郝澍;硒对黄曲霉毒素B_1抑制猪细胞免疫的拮抗作用及其机理研究[D];南京农业大学;2016年
3 关绚丽;基于转录组学的氧化胁迫下调控黄曲霉毒素合成的基因筛选和确证[D];中国农业科学院;2018年
4 史莹华;纳米级硅酸盐结构微粒(NSP)吸附猪饲粮中黄曲霉毒素的研究[D];浙江大学;2005年
5 胡娜;基因芯片技术在黄曲霉毒素生物合成相关基因检测中的应用研究[D];南昌大学;2006年
6 张雪辉;中药中黄曲霉毒素检测方法研究及模式识别在中药领域中的应用[D];中国协和医科大学;2004年
7 申海涛;黄曲霉毒素G_1诱发小鼠肺腺癌的组织发生及其对肺泡Ⅱ型上皮细胞影响的研究[D];河北医科大学;2007年
8 马良;黄曲霉毒素B_1高灵敏度检测技术研究[D];中国农业科学院;2007年
9 谢光洪;黄曲霉毒素B1免疫层析试纸条快速检测方法的研制[D];吉林大学;2008年
10 何婷;黄曲霉毒素纳米抗体研制及其免疫分析技术研究[D];中国农业科学院;2016年
中国硕士学位论文全文数据库 前10条
1 李声明;黄曲霉MAPK通路相关基因功能初步研究[D];福建农林大学;2015年
2 仲红;温度对黄曲霉生长发育和次级代谢的影响[D];福建农林大学;2015年
3 郭珍妮;水分胁迫对黄曲霉生长和产毒影响的初步研究[D];福建农林大学;2015年
4 叶柳青;曲古抑囷素A对黄曲霉产毒和生长调控机制的初步研究[D];福建农林大学;2015年
5 陈璐瑶;花生酱中黄曲霉毒素富集规律及其削减技术研究[D];福建农林大学;2018年
6 田尔诺;黄曲霉毒素B_1降解酶及其降解机制研究[D];湖北工业大学;2018年
7 马海艳;食品药品中痕量真菌毒素检测方法的研究与应用[D];河北医科大学;2018年
8 刘博伟;TNF-α上调CYP2A13对黄曲霉毒素G_1致肺泡上皮细胞损伤的影响[D];河北医科大学;2018年
9 李丽;槲皮素对黄曲霉毒素B_1致BRL-3A细胞毒性的保护作用[D];江南大学;2018年
10 胡淑荣;黄曲霉毒素B_1胶体金免疫层析技术在中药中应用研究[D];吉林农业大学;2018年
中国知网广告投放
 快捷付款方式  订购知网充值卡  订购热线  帮助中心
  • 400-819-9993
  • 010-62791813
  • 010-62985026