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《中国农业大学》 2015年
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RNA干扰在哺乳动物抗野田村病毒先天性免疫作用机制研究

樊晓旭  
【摘要】:在植物、线虫、果蝇中,宿主通过RNA 干扰(RNAi)作用,产生病毒来源的siRNA(小干扰RNA),发挥抗病毒防御作用。但是,在哺乳动物中,RNAi所发挥的这种抗病毒作用尚未得到证实。本论文通过一种经蚊子传播的RNA病毒,野田村病毒,Nodamura virus(NoV),感染哺乳动物,研究病毒感染宿主后,RNAi的诱导与抑制机制、模式识别受体在抗NoV先天性免疫中的作用以及与RNAi协同抗病毒效应。为了检测NoV病毒的复制和富集,首先制备了针对病毒衣壳蛋白(CP)及RNA依赖的RNA聚合酶(RdRP)的多克隆抗体,为病毒感染宿主研究提供了必要的研究工具。NoV感染BHK-21细胞及BALB/c乳鼠试验证明,该病毒通过B2蛋白抑制宿主RNAi功能来进行复制。当B2功能缺陷病毒株NoVΔB2感染宿主,机体内产生了大量的siRNAs,这些小RNA长度主要集中在22-nt、双链中20-nt的碱基基完全相互配对,并在3'端有2-nt的垂悬,能够迅速清除体内的病毒;而在野生型NoV感染过程中未检测到这种特征性的siRNAs。说明当RNAi作用不被病毒抑制时,小鼠能够通过有效的RNAi抗病毐作用,保护机体免受病毒致死性感染。这些结果与线虫、果蝇感染畜舍病毒(FHV)诱导的RNAi抗病毒效果类似,揭示RNAi也能在哺乳动物中发挥抗病毒免疫功能。通过制备野生型(C57BL/6)、RIG-Ⅰ-/-、MDA5-/-LGP2-/-MAVS-/-TLR3-/和 TLR7-/-小鼠胚胎成纤维细胞(MEFs)并感染NoV,研究结果表明,RIG-Ⅰ基因缺失的MEFs对NoV更易感,说明RIG-Ⅰ与宿主抗NoV感染有关。在NoV感染过程中,IFN-β在RIG-1-/-MEFs中基本未被诱导,而用IFN-β预处理细胞后,可提高细胞对NoV的抵抗力,但在这个过程中RNAi相关基因的表达并未明显得到诱导。说明NoV感染诱导了由RIG-Ⅰ介导的十扰素依赖性抗病毒保护作用。证实当宿主 RNAi功能受到抑制的情况下,RIG-Ⅰ通过干扰素依赖性作用抵抗NoV感染。通过NoVΔB2感染RIG-Ⅰ-/-MEFs,发现在RIG-Ⅰ功能缺失的情况下,RNAi无法有效抑制病毒的复制。NoV和NoVAB2感染野生型MEFs均会诱导RIG-Ⅰ、IFN-β和STAT1基因上调表达,但在表达水平上无明显差异。虽然NoVAB2感染RIG-Ⅰ-/-MEFs与野生型MEFs相比RNAi相关基因的表达并未出现明显差异,但通过NoVΔB2感染C57、RIG-Ⅰ-/-和MAVS-/-乳鼠的研究结果发现,当RNAi功能未被抑制的情况下,RIG-Ⅰ的抗病毒作用不依赖MAVS通路,而能够促进病毒相关siRNAs的大量产生。从而说明RIG-Ⅰ能够促进宿主RNAi的抗病毒作用。
【学位授予单位】:中国农业大学
【学位级别】:博士
【学位授予年份】:2015
【分类号】:S852.4

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