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《中国农业大学》 2016年
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酿酒酵母DDK激酶在DNA复制起始和时序调控中的功能研究

方丁强  
【摘要】:DNA复制的精确调控对于维持遗传信息的稳定传递具有重要作用。DNA复制的调控主要包括时间和空间两方面。在空间上,真核生物DNA复制起始于基因组上不同复制原点,并受到染色质结构等多重因素的影响。在时间上,这些复制原点并不是同步启动DNA复制,而是有先后之分。DNA复制的时序调控在调控基因表达、维持基因组稳定性等过程中都有重要作用。DDK激酶是参与DNA复制起始的重要因子,主要通过磷酸化DNA复制解旋酶的核心组分MCM复合体促进DNA复制起始。同时DDK激酶也是参与DNA复制时序调控的限量因子,在G1期低水平的DDK激酶优先作用于早期复制原点使其在S期早期起始复制,之后活性逐渐升高的DDK激酶开始作用于晚期复制原点,使其在S期晚期激活复制。然而,作为偶联复制起始和时序调控的关键限量因子,DDK激酶在这个过程中具体的分子机制并不清楚。而且,目前的“限量因子模型”无法解释这些限量因子是如何优先作用于早期复制起点的。针对这一问题,本研究首先通过酵母双杂交筛选发现,DDK的调节亚基Dbf4和转录因子Fkh1/Fkh2存在相互作用。进一步通过免疫共沉淀和GST-pull down证明Dbf4与Fkh1在细胞内和细胞外均能直接稳定地相互结合。物理上的相互作用暗示着Fkh1/Fkh2与DDK激酶在时序调控过程中的联系。FKH1和FKH2基因的敲除会显著降低G1期Dbf4在早期复制原点的募集。进一步通过DNA拷贝数分析实验表明,Fkh1和Fkh2的缺失导致早期复制起点的复制明显延迟。为深入了解Dbf4与Fkh1之间的联系,详细分析二者互作区域,结果表明Dbf4的C端主要负责与Fkh1/Fkh2的相互作用。该互作区段的缺失,与Fkh1/2的敲除一样,会导致早期复制起点延迟复制。更有意思的是,人为地将Dbf4 △C蛋白与Fkh1/2中负责结合DNA的forhead结构域直接融合,则可以让这些早期复制起点恢复正常复制。这些结果证明Fkh1/2可直接结合招募Dbf4到早期复制起点,从而决定早期复制起点的优先复制,回答了目前“限量因子模型”中所遗留的一个关键问题。尽管有多项研究已表明,Dbf4与Cdc7形成DDK激酶催化Mcm2-7解旋酶的磷酸化是真核DNA复制起始中的一个必需步骤,但这一步骤的具体功能到底是什么呢?酵母双杂交筛选中发现,参与DNA复制起始的另一个限量因子Sld3与MCM复合体中的两个亚基Mcm2和Mcm6存在相互作用。随后进一步将与Sld3结合的结构域鉴定到Mcm2和Mcm6的N端。Mcm2和Mcm6的N端富含DDK磷酸化位点,通过一个温度诱导的Dbf4降解实验,证明Mcm2/6与Sld3在细胞中的相互作用依赖DDK激酶。进一步分析已发表的Sld3晶体结构发现并通过实验证明,四个保守的带正电氨基酸残基参与MCM的互作,将它们突变为酸性氨基酸残基后导致细胞死亡。这些结果暗示DDK激酶磷酸化Mcm2和Mcm6会使其N端成为带负电区域,从而促进与Sld3的带正电氨基酸结构域的结合。为分析Mcm2/Mcm6N端的生理功能,通过遗传回补和流式细胞术实验发现,Mcm2和Mcm6N端与Sld3结合的部分对于细胞生长和DNA复制起始至关重要。进一步分析其分子机制发现,MCM6 N端缺失的突变体中,G1期Sld3在早期复制原点的募集消失,RPA在复制原点的募集也受到显著影响,后续的CMG复合体的装配随之受到破坏。上述结果说明,DDK激酶通过磷酸化Mcm2和Mcm6的N端促进限量因子Sld3的招募,从而介导复制解旋酶全酶——CMG复合体的装配,最终激活复制原点。DNA复制起始和时序调控的分子机制是真核DNA复制领域的关键科学问题,本论文揭示了Fkh1/2依赖的DDK激酶在早期复制原点的优先募集机制,进一步阐明了 DDK激酶在下游Sld3招募及复制解旋酶激活过程中的具体生物学功能。这些结果有助于加深人们对真核DNA复制起始控制这一影响细胞命运根本过程的认识。
【学位授予单位】:中国农业大学
【学位级别】:博士
【学位授予年份】:2016
【分类号】:Q75

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