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阿维链霉菌中转录调控因子SAV742和选择性σ因子σ~8的调控机制

孙地  
【摘要】:阿维链霉菌(Streptomyces avermitilis)产生的阿维菌素(avermectins)是一类十六元大环内酯类杀虫抗生素,广泛应用于医药、农业和畜牧业生产中,但阿维菌素生物合成的调控机制还有待于阐明。本工作研究了阿维链霉菌中一个新的AraC家族转录调控因子SAV742和选择性σ因子σ8(SAV741)的功能和调控机制。sav_742基因编码AraC家族转录调控因子。对该基因进行缺失、回补和过表达,通过表型观察和摇瓶发酵实验,初步证实SAV742负调控阿维菌素生物合成和阿维链霉菌生长、正调控形态分化过程。通过EMSA和qRT-PCR实验进一步证实,SAV742通过直接负调控阿维菌素生物合成结构基因aveF、aveA1、aveD和aveA4的表达,抑制阿维菌素合成。SAV742还可以直接调控自身基因和上游的sig8基因的转录。通过DNase I footprinting和定点突变实验确定了SAV742在自身启动子区的结合序列,并在受SAV742调控的ave结构基因及sig8的启动子区发现了类似的序列,通过序列比对得到了SAV742的保守结合序列RCCGM-N0-15-YHGSC(R:A或G,M:A或C,Y:C或T,H:A、C或T,S:C或G,N:任一核苷酸)。根据此保守序列在全基因组范围内预测了SAV742的靶基因,并通过实验验证了其中的26个新靶基因,它们分别参与了初级代谢、次级代谢和形态分化过程。因此,SAV742是阿维链霉菌中一个新的全局性转录调控因子,不仅调控阿维菌素合成,而且在协调调控阿维链霉菌多种生理过程中扮演了重要角色。σ8是阿维链霉菌中首个被研究的选择性σ因子,与天蓝色链霉菌σ8高度同源。通过构建sig8的缺失、回补和过表达菌株,利用摇瓶发酵和表型观察实验,初步证实σ8负调控阿维菌素生物合成,但不影响阿维链霉菌在正常情况下的生长和形态分化。通过EMSA、体外转录和qRT-PCR实验进一步证实,σ8通过间接抑制阿维菌素生物合成途径特异性调控基因aveR、直接激活下游基因sav_742的转录,调控阿维菌素的合成。与野生型菌株相比,sig8缺失株对NaCl、KC1、H2O2、二酰胺(diamide)和热激更为敏感。sig8的转录以依赖于σ8的方式受这些环境胁迫诱导。通过EMSA、体外转录和qRT-PCR实验确定了一系列参与热胁迫、氧化胁迫和渗透胁迫的σ8靶基因,表明σ8通过在胁迫条件下激活相关靶基因的表达,在保护阿维链霉菌响应胁迫反应中发挥了重要作用。通过5'-RACE确定了6个σ8靶基因的启动子区结构,并由此得到了σ8的保守结合序列BGVNVH-N15-GSNNHH(B:C,T 或 G;V:A,C 或 G;S:C或 G;H:A,C 或 T;N:任一核苷酸)。根据此保守序列预测了分属于17个功能类群的940个σ8靶基因,暗示σ8能够调控阿维链霉菌内的多种生理活动。在本研究工作中,发现了通过直接负调控阿维菌素生物合成结构基因转录,抑制阿维菌素合成的AraC家族转录调控因子SAV742和在转录水平上间接负调控阿维菌素合成的选择性σ因子σ8,为揭示阿维菌素生物合成的复杂调控网络、通过基因工程手段构建阿维菌素高产菌株奠定基础,具有重要的理论和实际意义。


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