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《中国农业大学》 2017年
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转ZmABP9棉花抗逆功能分析和CRISPR/Cas9介导的棉花基因定点突变初探

王春玲  
【摘要】:棉花是世界范围内种植范围最广的经济作物之一,同时也是棉籽油和棉纤维的主要来源。但是干旱、高盐等非生物胁迫严重制约着棉花生长、发育和产量。ZmABP9是通过酵母单杂交的方法从玉米(Zea mays)幼胚中克隆筛选得到的一个编码bZIP转录因子的基因,其编码蛋白脱落酸应答元件连接蛋白 9(ABA responsive element binding protein 9,ABP9)能与玉米 catalase1(Cat1)基因的ABRE2元件相互作用。ZmABP9的表达显著提高了拟南芥对多个非生物胁迫的耐受性,但在棉花中的作用研究较少。另外,由于棉花基因组的复杂性,利用CRISPR/Cas9技术对棉花基因组的编辑有一定的困难。因此本课题通过农杆菌介导的遗传转化技术将ZmABP9基因转到棉花中进行抗逆功能分析,同时对通过CRISPR/Cas9系统介导的棉花基因定点突变进行了初步研究,这对培育具有耐旱耐盐的棉花新品系以及通过CRISPR/Cas9技术进行棉花功能基因组学的研究具有重要意义。在本实验中,首先通过农杆菌介导的遗传转化方法将ABP9基因成功导入陆地棉(Gossypium hirsutum L.)品种R15,并成功获得12个独立的转基因棉花株系。选取L24和L66两个株系进行一系列的胁迫处理实验。结果表明,过表达ABP9基因综合提高了转基因棉花的耐盐耐旱性,包括在温室中转基因株系都具有更好的生长表型和更强壮的根系;在培养箱中转基因株系种子的萌发率,幼苗长度也都明显高于R15,而气孔开度和叶片下表皮气孔密度却低于R15。生理生化指标检测发现,在高盐和渗透胁迫下,转基因棉花叶片中的叶绿素,脯氨酸以及可溶性糖含量都高于R15叶片中的含量,而丙二醛(MDA)含量低于R15叶片的含量。特别是在干旱控水时,转基因棉花的叶片相对含水量(RWC)及复水后的存活率都高于同处理的R15植株。在盐胁迫下,转基因株系中的几个抗逆相关基因的表达量不仅相较于R15明显上调,而且其抗氧化酶的活性及酶基因的表达也都高于R15,增强了活性氧(ROS)的清除能力,提高了抗氧化能力,缓解了对细胞的伤害,组织染色也证明了这一点。另外,ABP9过表达增强了转基因株系在种子萌发,幼苗生长,气孔开度以及保卫细胞密度等生理过程中对外源ABA的敏感性。以棉花愈伤组织和生长一周的棉花子叶为材料,建立了稳定的,高效的棉花原生质体的制备及40%PEG4000介导的目标基因转化和瞬时表达体系。以棉花番茄红素脱氢酶(Phytoene desaturase,PDS)基因为靶标基因,选择合适的靶标位点,通过棉花原生质体的瞬时表达及农杆菌介导的遗传转化实现了利用CRISPR/Cas9系统对PDS基因的定点突变。综上所述,ABP9可能通过参与ABA-依赖的信号转导途径和ROS的代谢调节从而赋予了棉花耐盐耐旱等多种非生物胁迫耐性;通过CRISPR/Cas9技术实现了对棉花基因的定点编辑并获得突变体表型。这些结果为抗逆棉花新品种的培育以及棉花功能基因组学的研究提供了优良的资源和强有力的工具。
【学位授予单位】:中国农业大学
【学位级别】:博士
【学位授予年份】:2017
【分类号】:S562

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