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《中国农业大学》 2017年
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铁储藏蛋白大小与形状的调控

张胜利  
【摘要】:笼形蛋白(Protein cage)在自然界中广泛存在且发挥重要作用,其蛋白质外壳具有三个活性界面,分别为外表面、内表面以及亚基之间界面,通过化学和基因修饰这些界面可以赋予笼形蛋白新的功能特性。由于多亚基笼形蛋白具有对称性高、溶解度好、稳定性强、单分散等性质,所以具有合成纳米颗粒、包埋小分子、靶向传送并释放药物等功能。但自然界中现存的笼形蛋白数目、大小和形状有限,不能满足所有特定的应用要求。近年来,报道了几种制备新笼形蛋白的方法:从头设计新蛋白、增加二硫键、增加静电作用力、化学交联、金属离子介导和基因融合结构单元或片段等。但是这些方法都有两个主要的劣势:难度大和任务重,所以急需建立一种新方法来制备出不同属性的笼形蛋白。我们建立了 一种合成笼形蛋白的新方法,该方法的关键点在于重新设计目标蛋白的亚基界面,由3步组成:1、通过分析晶体结构找出目标蛋白的关键界面;2、找出该界面上的关键氨基酸;3、删除或者增加若干个氨基酸来重新设计亚基界面,使目标蛋白转化成新的笼形蛋白。铁储藏蛋白是广泛存在于动物、植物以及微生物中的一种笼形蛋白,能保持铁代谢的平衡,并且去除二价铁的毒性,由24个亚基组成,外径为12纳米,内径为8纳米,整个分子呈432轴对称。通过调节铁储藏蛋白亚基间的作用力可改变其组装方式,使24聚铁储藏蛋白分别转变为48聚和16聚新型笼形蛋白。实验结果如下:1、在铁储藏蛋白的4个亚基间界面中(C2、C3、C4和C3-C4),C3-C4界面所占比例最大,对铁储藏蛋白亚基组装最为重要。但是该界面中D螺旋上的部分氨基酸残基(139NEQVKA144)并不参与界面作用力,如果删除这些氨基酸残基可改变C3-C4界面的作用力,通过调节删除氨基酸的数目(Δ139NE、Δ139NEQV、A139NEQVKA和Δ139NEQVKAIK),可使界面作用力逐步改变。对这些突变体进行构建、转化、表达、纯化、表征和结晶后,发现:删除6个氨基酸后,突变体Δ139NEQVKA亚基自组装成外径为17纳米的新型48聚笼形蛋白,它包含两种亚基,这两种亚基的氨基酸序列完全一样,却有不同的三级结构,以1:1的比例组装成完整笼形蛋白。晶体溶解后,在溶液中存在48聚大分子,10个小时后,完全转变为由8个亚基组成的多聚体,前者在晶体中可稳定存在,后者在溶液中更稳定。本方法不仅改变了铁储藏蛋白的大小,而且有望改造自然界中其它笼形蛋白(如Dps、热休克蛋白、E2蛋白等)。2、通过分析铁储藏蛋白界面作用力发现:D螺旋对铁储藏蛋白的形成起着至关重要的作用,并且参与亚基两端两个疏水性核的形成。对突变体(▽139L、▽139LN、▽139LNE、V139LNEQ、▽139LNEQV、▽139LNEQVK、▽139LNEQVKA、▽139LNEQVKAI、V139LNEQVKAIK、▽139LNEQVKAIKE、▽139LNEQVP、V139LLLLLL、▽139AAAAAA、▽139PPPPPP、▽138YLNEQV和▽140NEQVKA)进行克隆、表达、纯化、表征和结晶后发现:当在D螺旋中间插入7个氨基酸时,可使铁储藏蛋白转变为新型扁球形笼形蛋白,该蛋白包含16个氨基酸序列完全一样、结构却各不相同的亚基。转变因素只与插入氨基酸的数目有关(必须多于5个氨基酸),与插入氨基酸的种类无关。该新蛋白不仅可以作为载体包埋活性小分子,还可以靶向肿瘤细胞,具有重要应用价值。该方法还可用于改造其它种类的笼形蛋白,赋予其新的功能和属性。
【学位授予单位】:中国农业大学
【学位级别】:博士
【学位授予年份】:2017
【分类号】:TQ931

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