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《中国农业大学》 2017年
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铁储藏蛋白大小与形状的调控

张胜利  
【摘要】:笼形蛋白(Protein cage)在自然界中广泛存在且发挥重要作用,其蛋白质外壳具有三个活性界面,分别为外表面、内表面以及亚基之间界面,通过化学和基因修饰这些界面可以赋予笼形蛋白新的功能特性。由于多亚基笼形蛋白具有对称性高、溶解度好、稳定性强、单分散等性质,所以具有合成纳米颗粒、包埋小分子、靶向传送并释放药物等功能。但自然界中现存的笼形蛋白数目、大小和形状有限,不能满足所有特定的应用要求。近年来,报道了几种制备新笼形蛋白的方法:从头设计新蛋白、增加二硫键、增加静电作用力、化学交联、金属离子介导和基因融合结构单元或片段等。但是这些方法都有两个主要的劣势:难度大和任务重,所以急需建立一种新方法来制备出不同属性的笼形蛋白。我们建立了 一种合成笼形蛋白的新方法,该方法的关键点在于重新设计目标蛋白的亚基界面,由3步组成:1、通过分析晶体结构找出目标蛋白的关键界面;2、找出该界面上的关键氨基酸;3、删除或者增加若干个氨基酸来重新设计亚基界面,使目标蛋白转化成新的笼形蛋白。铁储藏蛋白是广泛存在于动物、植物以及微生物中的一种笼形蛋白,能保持铁代谢的平衡,并且去除二价铁的毒性,由24个亚基组成,外径为12纳米,内径为8纳米,整个分子呈432轴对称。通过调节铁储藏蛋白亚基间的作用力可改变其组装方式,使24聚铁储藏蛋白分别转变为48聚和16聚新型笼形蛋白。实验结果如下:1、在铁储藏蛋白的4个亚基间界面中(C2、C3、C4和C3-C4),C3-C4界面所占比例最大,对铁储藏蛋白亚基组装最为重要。但是该界面中D螺旋上的部分氨基酸残基(139NEQVKA144)并不参与界面作用力,如果删除这些氨基酸残基可改变C3-C4界面的作用力,通过调节删除氨基酸的数目(Δ139NE、Δ139NEQV、A139NEQVKA和Δ139NEQVKAIK),可使界面作用力逐步改变。对这些突变体进行构建、转化、表达、纯化、表征和结晶后,发现:删除6个氨基酸后,突变体Δ139NEQVKA亚基自组装成外径为17纳米的新型48聚笼形蛋白,它包含两种亚基,这两种亚基的氨基酸序列完全一样,却有不同的三级结构,以1:1的比例组装成完整笼形蛋白。晶体溶解后,在溶液中存在48聚大分子,10个小时后,完全转变为由8个亚基组成的多聚体,前者在晶体中可稳定存在,后者在溶液中更稳定。本方法不仅改变了铁储藏蛋白的大小,而且有望改造自然界中其它笼形蛋白(如Dps、热休克蛋白、E2蛋白等)。2、通过分析铁储藏蛋白界面作用力发现:D螺旋对铁储藏蛋白的形成起着至关重要的作用,并且参与亚基两端两个疏水性核的形成。对突变体(▽139L、▽139LN、▽139LNE、V139LNEQ、▽139LNEQV、▽139LNEQVK、▽139LNEQVKA、▽139LNEQVKAI、V139LNEQVKAIK、▽139LNEQVKAIKE、▽139LNEQVP、V139LLLLLL、▽139AAAAAA、▽139PPPPPP、▽138YLNEQV和▽140NEQVKA)进行克隆、表达、纯化、表征和结晶后发现:当在D螺旋中间插入7个氨基酸时,可使铁储藏蛋白转变为新型扁球形笼形蛋白,该蛋白包含16个氨基酸序列完全一样、结构却各不相同的亚基。转变因素只与插入氨基酸的数目有关(必须多于5个氨基酸),与插入氨基酸的种类无关。该新蛋白不仅可以作为载体包埋活性小分子,还可以靶向肿瘤细胞,具有重要应用价值。该方法还可用于改造其它种类的笼形蛋白,赋予其新的功能和属性。
【关键词】:天然笼形蛋白 人造笼形蛋白 铁储藏蛋白 界面设计 大小与形状调节
【学位授予单位】:中国农业大学
【学位级别】:博士
【学位授予年份】:2017
【分类号】:TQ931
【目录】:
  • 摘要5-7
  • Abstract7-14
  • 缩略词表14-15
  • 第一章 绪论15-39
  • 1.1 天然笼形蛋白15-21
  • 1.1.1 天然笼形蛋白简介15-16
  • 1.1.2 天然笼形蛋白结构特征16
  • 1.1.3 天然笼形蛋白举例16-21
  • 1.2 设计合成的笼形蛋白21-27
  • 1.2.1 人造笼形蛋白简介21-24
  • 1.2.2 人造笼形蛋白举例及应用24-27
  • 1.3 铁储藏蛋白的结构与功能27-37
  • 1.3.1 铁储藏蛋白简介27-28
  • 1.3.2 铁储藏蛋白分子的结构和功能28-29
  • 1.3.3 植物、动物和微生物铁储藏蛋白之间的差异29-32
  • 1.3.4 铁核形成过程32-33
  • 1.3.5 铁储藏蛋白的应用33-37
  • 1.4 研究目的与意义37
  • 1.5 研究内容与技术路线37-39
  • 1.5.1 研究内容37-38
  • 1.5.2 技术路线38-39
  • 第二章 新型四十八聚笼形蛋白的制备与表征39-63
  • 2.1 前言39-40
  • 2.2 材料与方法40-49
  • 2.2.1 实验材料和仪器设备40-43
  • 2.2.2 实验方法43-49
  • 2.3 结果与讨论49-62
  • 2.3.1 突变体表达载体的构建49-50
  • 2.3.2 人重组铁储藏蛋白及突变体的分离纯化50-53
  • 2.3.3 亚基分子量测定53-54
  • 2.3.4 沉降速率超离心测定沉降系数54-55
  • 2.3.5 沉降平衡法测定突变体亚基数目55
  • 2.3.6 非变性质谱测定亚基数目55-56
  • 2.3.7 透射电镜图56
  • 2.3.8 X-ray晶体结构56-59
  • 2.3.9 负染电镜二维分类59-60
  • 2.3.10 高聚物与低聚物相互转变60-61
  • 2.3.11 晶体亚基与溶液亚基对比61-62
  • 2.4 小结62-63
  • 第三章 新型十六聚笼形蛋白的制备与表征63-85
  • 3.1 前言63-64
  • 3.2 材料与方法64-68
  • 3.2.1 实验材料和仪器设备64
  • 3.2.2 实验方法64-68
  • 3.3 结果与讨论68-84
  • 3.3.1 突变体表达载体的构建68-70
  • 3.3.2 人重组铁储藏蛋白及突变体的分离纯化70-72
  • 3.3.3 亚基分子量测定72-73
  • 3.3.4 沉降速率超离心测定沉降系数73
  • 3.3.5 沉降平衡法测定突变体亚基数目73-74
  • 3.3.6 圆二色谱测定突变体二级结构74
  • 3.3.7 荧光光谱测定微环境的变化74-75
  • 3.3.8 透射电镜图75-76
  • 3.3.9 冷冻电镜二维分类76
  • 3.3.10 插入氨基酸的位置和数目对组装的影响76-77
  • 3.3.11 X-ray晶体结构77-81
  • 3.3.12 铁氧化能力对比81
  • 3.3.13 突变体的酸稳定性81-82
  • 3.3.14 突变体包埋活性82-83
  • 3.3.15 癌细胞的吸收效率83-84
  • 3.4 小结84-85
  • 第四章 全文结论与展望85-87
  • 4.1 总结85
  • 4.2 创新点85-86
  • 4.3 展望86-87
  • 参考文献87-97
  • 致谢97-99
  • 个人简介99-100

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