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《中国农业大学》 2017年
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高黏附力重组乳酸乳球菌靶向投递KiSS1蛋白对结直肠癌细胞的抑制作用研究

张博  
【摘要】:口服给药是最常用的药物治疗方式,然而对于某些蛋白质类活性物质和药物在经过口服后往往由于胃肠的苛刻环境而发生失活或降解,因此不能发挥其正常功效。近年来,乳酸菌被认为是最有潜力的作为敏感性功能蛋白和药物的投递载体。其中,乳酸乳球菌作为一种理想的功能蛋白投递载体,具有非入侵性,抗原性弱,胞外分泌蛋白少等优点。利用乳酸乳球菌表达细菌或病毒的抗原基因方面已经取得了很大的进步,然而对于利用乳酸乳球菌投递功能蛋白用于癌症治疗的可行性却少有报道。KiSS1蛋白是一种癌转移抑制蛋白,已经报道了在各种癌症中具有转移抑制作用。然而这种功能蛋白是否可以利用乳酸菌进行表达并具有功能活性应用于癌症治疗中未见报道。本论文主要探究乳酸乳球菌作为KiSS1的投递表达载体的可行性,并通过重组植物乳杆菌CwaA黏附蛋白改善乳酸乳球菌黏附特性,同时加入RGD修饰标签修饰KiSS1蛋白来增强投递的靶向性和对结直肠癌的抑制效果。为利用乳酸乳球菌作为功能蛋白投递载体在癌症治疗中的应用提供了理论基础。本研究首先对实验室保存的一株黏附力较好的植物乳杆菌NL42进行了全基因组测序,通过比较基因组学的分析方法,发现并鉴定了参与植物乳杆菌黏附作用的新的功能蛋白CwaA,通过在乳酸乳球中表达该黏附蛋白显著改善了乳酸乳球菌的黏附特性,以期利用该菌株作为肠道活体投递功能蛋白的模式载体菌株。研究利用乳酸乳球菌Nice表达系统成功分泌表达了人源的KiSS1蛋白,并通过体外实验验证了 KiSS1蛋白对于人结直肠癌细胞HT-29具有增殖迁移抑制效果,主要表现在促进肿瘤细胞凋亡,并通过细胞表面的GPR54受体激活ERK-MAPK信号通路,实现对MMP-9的下调表达而发挥其功能。为了增强投递的靶向性,本研究选用了对癌细胞表面整合素有特异性结合的配体RGD基序修饰KiSS1蛋白,成功实现了乳酸乳球菌表达融合蛋白KiSSIRGD。加入RGD靶向配体基序标签后,HT-29细胞对融合KiSS1蛋白的吸收更强,同时也增强了 KiSS1蛋白对HT-29细胞的增殖抑制,迁移抑制和促凋亡作用效果。通过利用Caco2单层细胞模型模拟小肠上皮细胞来验证功能蛋白的转运和吸收,实验结果证实了带有和不带有RGD的KiSS1蛋白均可以通过Caco2细胞单层的吸收转运。这些研究结果证实了乳酸菌作为功能蛋白KiSS1投递载体用于癌症治疗的可行性,而且这种投递作用不局限于黏膜表面的投递治疗也可以用于周身投递治疗。最后我们利用黏附力增强的乳酸乳球菌表达了 RGD修饰的KiSS1蛋白,与野生型乳酸乳球菌相比较在功能蛋白分泌量和投递效果方面进一步增强,更有利于日后应用在口服投递治疗中。本研究阐明了益生菌-乳酸乳球菌可以通过基因工程的定向改造用于分泌具有生物活性的RGD修饰的KiSS1蛋白,并且所分泌的蛋白可以通过小肠的转运吸收,为利用乳酸乳球菌投递功能蛋白用于癌症治疗产品的开发及应用提供重要的理论依据。
【关键词】:乳酸乳球菌 黏附蛋白CwaA KiSS1RGD 投递载体 结直肠癌
【学位授予单位】:中国农业大学
【学位级别】:博士
【学位授予年份】:2017
【分类号】:R96
【目录】:
  • 摘要4-5
  • Abstract5-14
  • 缩略词表14-15
  • 第一章 绪论15-36
  • 1.1 乳酸菌作为功能因子投递载体的研究概况15-22
  • 1.1.1 乳酸菌15
  • 1.1.2 乳酸菌的表达系统15-17
  • 1.1.3 乳酸菌的表达形式17-19
  • 1.1.4 乳酸菌作为粘膜投递载体的研究进展19-22
  • 1.2 乳酸菌黏附性能及黏附机制研究进展22-25
  • 1.2.1 乳酸菌黏附的作用22-23
  • 1.2.2 乳酸菌的黏附素23-25
  • 1.2.3 乳酸菌黏附素受体25
  • 1.3 Kisspeptin的研究进展25-31
  • 1.3.1 Kisspeptin的发现25-26
  • 1.3.2 KiSS1参与肿瘤侵袭、转移的潜在机制26-29
  • 1.3.3 KiSS1蛋白的生理功能29
  • 1.3.4 KiSS1与人类肿瘤29-31
  • 1.4 RGD肽在肿瘤治疗中的应用31-34
  • 1.4.1 RGD肽在肿瘤影像中的应用31-32
  • 1.4.2 RGD肽抑制肿瘤细胞的黏附迁移32
  • 1.4.3 RGD肽对肿瘤细胞凋亡的作用32-33
  • 1.4.4 RGD肽对肿瘤血管生成的影响33
  • 1.4.5 RGD肽在疾病治疗中的靶向作用33-34
  • 1.5 立体依据及研究意义34-35
  • 1.6 主要研究内容35-36
  • 第二章 比较基因组学鉴定植物乳杆菌NL42黏附蛋白36-49
  • 2.1 引言36
  • 2.2 材料与试剂36-37
  • 2.2.1 实验菌株及培养方法36
  • 2.2.2 主要试剂及溶液配制36-37
  • 2.2.3 主要仪器设备37
  • 2.3 实验方法37-38
  • 2.3.1 乳杆菌基因组的提取37-38
  • 2.3.2 琼脂糖凝胶电泳38
  • 2.3.3 基因组测序及比较基因组学分析方法38
  • 2.3.4 其他生物信息学软件38
  • 2.4 结果与分析38-47
  • 2.4.1 植物乳杆菌NL42全基因组测序及分析38-39
  • 2.4.2 植物乳杆菌NL42的亲缘关系分析39-41
  • 2.4.3 植物乳杆菌NL42与其他植物乳杆菌编码区比较分析41-42
  • 2.4.4 植物乳杆菌基因的COG分类42
  • 2.4.5 植物乳杆菌黏附蛋白分析42-43
  • 2.4.6 比较基因组学分析CwaA蛋白结构43-44
  • 2.4.7 CwaA氨基酸序列及蛋白结构分析44-47
  • 2.5 讨论47-48
  • 2.6 小结48-49
  • 第三章 CwaA提高了乳酸乳球菌NZ9000对肠上皮细胞的黏附能力49-64
  • 3.1 引言49
  • 3.2 材料与试剂49-52
  • 3.2.1 实验菌株与质粒49-50
  • 3.2.2 菌株培养方法50
  • 3.2.3 主要试剂及溶液配制50-51
  • 3.2.4 主要仪器设备51-52
  • 3.3 实验方法52-56
  • 3.3.1 乳酸乳球菌NZ9000感受态制备及转化52
  • 3.3.2 cwaA基因的克隆及诱导表达52
  • 3.3.3 蛋白免疫印迹(westernblot)52-54
  • 3.3.4 自聚集实验54
  • 3.3.5 疏水性实验54
  • 3.3.6 HT-29细胞的培养54
  • 3.3.7 黏附实验54-55
  • 3.3.8 高碘酸钠和胰酶处理细胞55
  • 3.3.9 糖抑制实验55
  • 3.3.10 乳酸菌竞争性抑制病原菌黏附实验55
  • 3.3.11 实验数据分析55-56
  • 3.4 结果与分析56-62
  • 3.4.1 cwaA基因的PCR扩增56
  • 3.4.2 cwaA基因的表达载体构建及转化56-57
  • 3.4.3 Western blot检测CwaA在乳酸乳球菌NZ9000中的表达57-58
  • 3.4.4 重组菌株自聚集能力变化58
  • 3.4.5 重组菌株疏水性变化58-59
  • 3.4.6 重组菌株对肠上皮细胞HT-29的黏附性59-60
  • 3.4.7 重组菌株对病原菌抵抗能力的提高60-61
  • 3.4.8 CwaA黏附受体的评价61-62
  • 3.5 讨论62-63
  • 3.6 小结63-64
  • 第四章 乳酸菌分泌表达肿瘤转移抑制蛋白KiSS164-80
  • 4.1 引言64
  • 4.2 材料与试剂64-67
  • 4.2.1 试验菌株及培养方法64-65
  • 4.2.2 主要试剂及溶液配制65-66
  • 4.2.3 仪器与设备66
  • 4.2.4 实验引物66-67
  • 4.3 实验方法67-70
  • 4.3.1 kiss1基因的克隆及诱导表达67
  • 4.3.2 乳酸乳球菌NZ9000感受态制备及转化67
  • 4.3.3 乳酸菌分泌蛋白Elisa测定67-68
  • 4.3.4 Western blot检测68
  • 4.3.5 提取细菌分泌蛋白68
  • 4.3.6 MTT试验68
  • 4.3.7 Annexin v /PI法测细胞凋亡68-69
  • 4.3.8 划痕试验69
  • 4.3.9 细胞蛋白的提取69
  • 4.3.10 细胞RNA的提取69-70
  • 4.3.11 实验数据分析70
  • 4.4 结果与分析70-78
  • 4.4.1 KiSS1表达载体的构建70-71
  • 4.4.2 Western blot检测胞内外蛋白分泌71-72
  • 4.4.3 表达条件的优化和KiSS1分泌量的测定72-73
  • 4.4.4 KiSS1蛋白抑制了HT-29细胞的增殖73-74
  • 4.4.5 KiSS1蛋白对HT-29细胞的迁移抑制作用74-75
  • 4.4.6 KiSS1改变了HT-29细胞形态,诱导了HT-29细胞的凋亡75-76
  • 4.4.7 KiSS1对HT-29细胞作用通路的研究76-78
  • 4.5 讨论78-79
  • 4.6 小结79-80
  • 第五章 RGD修饰肽增加了KiSS1对HT-29细胞的靶向性及抑制作用80-92
  • 5.1 引言80
  • 5.2 材料与试剂80-82
  • 5.2.1 试验菌株及培养方法80-81
  • 5.2.2 主要试剂及溶液配制81
  • 5.2.3 仪器与设备81-82
  • 5.3 实验方法82-84
  • 5.3.1 共聚焦显微镜观察HT-29细胞吸收带有和不带有RGD的KiSS1蛋白82
  • 5.3.2 KiSS1RGD的克隆及诱导表达82-83
  • 5.3.3 Elisa测定菌株分泌KiSS1蛋白的量83
  • 5.3.4 共聚焦检测分泌的KiSS1RGD活性83
  • 5.3.5 MTT试验83
  • 5.3.6 凋亡试验83
  • 5.3.7 划痕试验83
  • 5.3.8 分泌肽对Caco2细胞单层的转运吸收83-84
  • 5.3.9 实验数据分析84
  • 5.4 实验结果84-90
  • 5.4.1 RGD肽增加了HT-29细胞对KiSS1的吸收作用84-85
  • 5.4.2 乳酸乳球菌表达RGD修饰的KiSS1蛋白85-86
  • 5.4.3 分泌肽与FITC标记的荧光肽竞争结合HT-29细胞86-87
  • 5.4.4 带有RGD的肽对HT-29细胞增殖的影响87
  • 5.4.5 带有RGD的肽对HT-29细胞凋亡的影响87-89
  • 5.4.6 带有RGD的肽对HT-29细胞迁移的影响89-90
  • 5.4.7 乳酸菌分泌蛋白KiSS1和KiSS1RGD对小肠上皮细胞Caco2的穿膜作用90
  • 5.5 讨论90-91
  • 5.6 小结91-92
  • 第六章 黏附力提高的乳酸乳球菌表达RGD修饰的KiSS1蛋白92-101
  • 6.1 引言92
  • 6.2 材料与试剂92-93
  • 6.2.1 实验菌株及培养方法92-93
  • 6.2.2 主要试剂及溶液配制93
  • 6.2.3 主要仪器设备93
  • 6.3 实验方法93-95
  • 6.3.1 共表达载体的构建93-94
  • 6.3.2 乳酸乳球菌NZ9000感受态制备及转化94
  • 6.3.3 乳酸菌全细胞蛋白、细胞壁蛋白及分泌蛋白的提取94
  • 6.3.4 Western blot检测94
  • 6.3.5 KiSS1的Elisa测定94
  • 6.3.6 caspase3和caspase9酶活的测定94-95
  • 6.3.7 实验数据分析95
  • 6.4 结果与分析95-99
  • 6.4.1 构建共表达载体95-97
  • 6.4.2 Western blot检测蛋白表达97
  • 6.4.3 黏附菌与非黏附菌投递的KiSS1RGD的量97-98
  • 6.4.4 黏附与非黏附菌株对caspase3,caspase9酶活的影响98-99
  • 6.5 讨论99
  • 6.6 小结99-101
  • 第七章 全文结论与展望101-103
  • 7.1 结论101-102
  • 7.2 论文创新点102
  • 7.3 展望102-103
  • 参考文献103-118
  • 附录118-123
  • 致谢123-125
  • 个人简介125

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