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《中国农业大学》 2017年
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高黏附力重组乳酸乳球菌靶向投递KiSS1蛋白对结直肠癌细胞的抑制作用研究

张博  
【摘要】:口服给药是最常用的药物治疗方式,然而对于某些蛋白质类活性物质和药物在经过口服后往往由于胃肠的苛刻环境而发生失活或降解,因此不能发挥其正常功效。近年来,乳酸菌被认为是最有潜力的作为敏感性功能蛋白和药物的投递载体。其中,乳酸乳球菌作为一种理想的功能蛋白投递载体,具有非入侵性,抗原性弱,胞外分泌蛋白少等优点。利用乳酸乳球菌表达细菌或病毒的抗原基因方面已经取得了很大的进步,然而对于利用乳酸乳球菌投递功能蛋白用于癌症治疗的可行性却少有报道。KiSS1蛋白是一种癌转移抑制蛋白,已经报道了在各种癌症中具有转移抑制作用。然而这种功能蛋白是否可以利用乳酸菌进行表达并具有功能活性应用于癌症治疗中未见报道。本论文主要探究乳酸乳球菌作为KiSS1的投递表达载体的可行性,并通过重组植物乳杆菌CwaA黏附蛋白改善乳酸乳球菌黏附特性,同时加入RGD修饰标签修饰KiSS1蛋白来增强投递的靶向性和对结直肠癌的抑制效果。为利用乳酸乳球菌作为功能蛋白投递载体在癌症治疗中的应用提供了理论基础。本研究首先对实验室保存的一株黏附力较好的植物乳杆菌NL42进行了全基因组测序,通过比较基因组学的分析方法,发现并鉴定了参与植物乳杆菌黏附作用的新的功能蛋白CwaA,通过在乳酸乳球中表达该黏附蛋白显著改善了乳酸乳球菌的黏附特性,以期利用该菌株作为肠道活体投递功能蛋白的模式载体菌株。研究利用乳酸乳球菌Nice表达系统成功分泌表达了人源的KiSS1蛋白,并通过体外实验验证了 KiSS1蛋白对于人结直肠癌细胞HT-29具有增殖迁移抑制效果,主要表现在促进肿瘤细胞凋亡,并通过细胞表面的GPR54受体激活ERK-MAPK信号通路,实现对MMP-9的下调表达而发挥其功能。为了增强投递的靶向性,本研究选用了对癌细胞表面整合素有特异性结合的配体RGD基序修饰KiSS1蛋白,成功实现了乳酸乳球菌表达融合蛋白KiSSIRGD。加入RGD靶向配体基序标签后,HT-29细胞对融合KiSS1蛋白的吸收更强,同时也增强了 KiSS1蛋白对HT-29细胞的增殖抑制,迁移抑制和促凋亡作用效果。通过利用Caco2单层细胞模型模拟小肠上皮细胞来验证功能蛋白的转运和吸收,实验结果证实了带有和不带有RGD的KiSS1蛋白均可以通过Caco2细胞单层的吸收转运。这些研究结果证实了乳酸菌作为功能蛋白KiSS1投递载体用于癌症治疗的可行性,而且这种投递作用不局限于黏膜表面的投递治疗也可以用于周身投递治疗。最后我们利用黏附力增强的乳酸乳球菌表达了 RGD修饰的KiSS1蛋白,与野生型乳酸乳球菌相比较在功能蛋白分泌量和投递效果方面进一步增强,更有利于日后应用在口服投递治疗中。本研究阐明了益生菌-乳酸乳球菌可以通过基因工程的定向改造用于分泌具有生物活性的RGD修饰的KiSS1蛋白,并且所分泌的蛋白可以通过小肠的转运吸收,为利用乳酸乳球菌投递功能蛋白用于癌症治疗产品的开发及应用提供重要的理论依据。
【学位授予单位】:中国农业大学
【学位级别】:博士
【学位授予年份】:2017
【分类号】:R96

【参考文献】
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