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《中国农业大学》 2017年
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丙酸产甲烷菌系的驯化过程及生物强化作用研究

李颖  
【摘要】:即能处理有机废弃物又可产生清洁能源的沼气发酵技术在我国得到了较快的发展,然而该技术存在低浓度发酵经济性差,高浓度发酵运行不稳定的问题。在实现稳定的高浓度厌氧发酵进程中,挥发性脂肪酸累积导致的产气抑制是亟需解决的问题,因此,本文以厌氧发酵中极易累积的丙酸、乙酸为目标去除物,构建丙酸产甲烷菌系(含有互营丙酸氧化菌群、氢型产甲烷菌群及乙酸裂解产甲烷菌群),对丙酸氧化为乙酸,乙酸产甲烷及H2+CO2产甲烷三个代谢步骤进行整体的生物强化,探讨解除酸抑制的生物强化模式,分析评价生物强化作用效果,并从微生物群落结构演替、微生物网络关系及基因功能差异等方面揭示生物强化作用机理,得出的主要结论如下:经长期驯化获得了多种功能的丙酸产甲烷菌系:利用固体沉积的静态驯化方法获得了 OLR承受力为2.5gHprL-1 d1-,平均容积产甲烷率为1.20LL-1d-1,丙酸耐受浓度超过11.0gL-1的高浓度丙酸产甲烷菌群,该菌群的优势功能菌为丙酸氧化菌Syntrophobacter及产甲烷菌Methanoculleus,Methanothrix;利用阶梯性降低pH的驯化方法获得了 pH在4.8-6.0下稳定产气的耐酸丙酸产甲烷菌群,其群落组成为丙酸氧化菌Smithella、Syntrophobacter、Pelotomaculum办Syntrophomonas 及产甲烷菌群 Methanothrix、Methanolinea、Methanospirillhm。证实了丙酸产甲烷菌群的生物强化作用:丙酸产甲烷菌群可提高厌氧发酵的有机负荷2倍,平均甲烷含量、容积产甲烷率、VS产甲烷率分别提高24.04%(76.54%),0.22L L-1 d-1(366.67%)及0.23 Lg-1VSd-1(287.50%);投加耐酸丙酸产甲烷菌群可促进酸败恢复,在一周内恢复发酵系统的初始产气水平,且生物强化后容积产气量比生物强化前提高30-35%;丙酸产甲烷菌群可缓解3.0gN L-1的氨氮抑制,1倍剂量(0.3g细胞干重L-1d-1)的生物强化可以防止失稳的发酵体系进一步恶化,在丙酸浓度为8500mgL-1,乙酸浓度为3000mgL-1,容积产甲烷量低于0.001L L-1 d-1时,2倍剂量的生物强化可有效地促进发酵体系恢复产气,生物强化后,平均容积甲烷产量、甲烷转化率及丙酸降解率分别提高了 158 mL L-1 d-1 48%及62%。揭示了生物强化作用机理:生物强化可调整微生物群落结构,提高有益功能菌群的生物量,利用高浓度丙酸产甲烷菌群进行生物强化时,提高了被强化发酵体系中的产甲烷菌Methanothrix、丙酸氧化菌Syntrophobacter氨基酸降解菌Aminivibrio、发酵细菌Pelolinea、Proteiniphilum的生物量:利用耐酸丙酸产甲烷菌群进行生物强化时提高乙酸型产甲烷菌Methanothrix及氢型产甲烷菌的Methanolinea的相对丰度。此外,在基因水平上,生物强化增强了微生物参与膜运输及细胞运动的基因功能。本文提供了强化挥发性脂肪酸降解并提高产甲烷的生物强化菌群的驯化方法及不同功能的菌剂;证实了丙酸产甲烷菌群可解除酸抑制、促进酸败恢复及缓解氨抑制,进而提高厌氧发酵性能;丰富了对生物强化作用机理的认识,为生物强化技术在厌氧发酵中的应用提供了实验及理论基础,推进了其实用化进程。
【关键词】:厌氧消化 生物强化 丙酸产甲烷菌群 酸抑制 氨抑制 宏基因组测序
【学位授予单位】:中国农业大学
【学位级别】:博士
【学位授予年份】:2017
【分类号】:S216.4;Q93
【目录】:
  • 摘要3-5
  • ABSTRACT5-7
  • 缩略词7-13
  • 第一章 绪论13-27
  • 1.1 研究背景及意义13-14
  • 1.2 生物强化在厌氧消化中的应用14-18
  • 1.2.1 水解产酸阶段的生物强化14-15
  • 1.2.2 产氢产乙酸阶段的生物强化15-16
  • 1.2.3 产甲烷阶段的生物强化16
  • 1.2.4 提高生物强化菌剂稳定性的方式16-17
  • 1.2.5 生物强化厌氧发酵的研究不足及挑战17-18
  • 1.3 厌氧发酵酸抑制作用机理18-19
  • 1.4 厌氧发酵酸抑制的应对途径19-20
  • 1.4.1 调节pH值19
  • 1.4.2 添加微量元素19-20
  • 1.4.3 生物强化20
  • 1.5 研究内容的提出及依据20-24
  • 1.5.1 生物强化丙酸产甲烷过程的提出依据20-21
  • 1.5.2 以丙酸产甲烷菌群为生物强化菌剂的提出依据21-23
  • 1.5.3 驯化多种丙酸产甲烷菌群的提出依据23-24
  • 1.5.4 宏基因组测序技术分析微生物群落的依据24
  • 1.6 研究目的、内容及技术路线24-27
  • 1.6.1 研究目的24
  • 1.6.2 研究内容24-25
  • 1.6.3 技术路线25-27
  • 第二章 高浓度丙酸产甲烷菌系的富集及微生物群落分析27-53
  • 2.1 引言27
  • 2.2 材料与方法27-32
  • 2.2.1 接种物及培养基27
  • 2.2.2 实验装置与实验设计27-28
  • 2.2.3 发酵性能测试及分析方法28-29
  • 2.2.4 宏基因组分析方法29-32
  • 2.3 静态丙酸产甲烷菌群富集体系的发酵性能32-33
  • 2.4 动态丙酸产甲烷菌群富集体系的发酵性能33-35
  • 2.5 静态与动态驯化体系厌氧发酵性能统计分析与对比35-37
  • 2.6 静态丙酸产甲烷菌富集体系的群落解析37-46
  • 2.6.1 细菌的分类鉴定38-40
  • 2.6.2 古菌的分类鉴定40-43
  • 2.6.3 微生物的关系网络43-46
  • 2.7 静态丙酸产甲烷菌富集体系中物质代谢与微生物关系46-48
  • 2.8 静态丙酸产甲烷菌富集体系中微生物基因功能分析48-52
  • 2.8.1 细菌基因功能鉴定与差异分析48-50
  • 2.8.2 古菌基因功能鉴定与差异分析50-52
  • 2.9 本章小结52-53
  • 第三章 提高厌氧发酵有机负荷的生物强化作用及微生物分析53-76
  • 3.1 引言53
  • 3.2 材料与方法53-55
  • 3.2.1 接种物及原料53-54
  • 3.2.2 生物强化菌剂54
  • 3.2.3 实验装置及实验设计54
  • 3.2.4 厌氧发酵性能测试指标与方法54-55
  • 3.2.5 宏基因组分析方法55
  • 3.3 厌氧发酵酸抑制过程55-56
  • 3.4 丙酸产甲烷菌群对酸抑制发酵体系发酵性能的影响56-61
  • 3.4.1 未投加生物强化菌剂的厌氧发酵体系的性能57-58
  • 3.4.2 投加菌液对厌氧发酵过程的影响58
  • 3.4.3 投加灭菌菌液对厌氧发酵过程的影响58
  • 3.4.4 投加菌泥对厌氧发酵过程的影响58-59
  • 3.4.5 各反应器不同阶段发酵性能的统计与对比分析59-61
  • 3.5 丙酸产甲烷菌液生物强化效果分析61-62
  • 3.6 生物强化对厌氧发酵体系内微生物群落演替及构成的影响62-67
  • 3.6.1 生物强化对厌氧发酵体系内古菌群落演替的影响62-65
  • 3.6.2 生物强化对厌氧发酵体系内细菌群落演替的影响65-66
  • 3.6.3 生物强化对厌氧发酵体系内细菌菌属组成结构的影响66-67
  • 3.7 生物强化对厌氧发酵体系内微生物菌属网络关系的影响67-71
  • 3.8 生物强化前后基因功能差异分析71-75
  • 3.8.1 生物强化前后细菌基因功能差异分析71-73
  • 3.8.2 生物强化前后古菌基因功能差异分析73-75
  • 3.9 本章小结75-76
  • 第四章 低PH丙酸产甲烷菌群的驯化及微生物群落分析76-91
  • 4.1 引言76
  • 4.2 材料及方法76-78
  • 4.2.1 接种物及培养基76-77
  • 4.2.2 实验装置及实验设计77
  • 4.2.3 厌氧发酵性能分析方法77
  • 4.2.4 宏基因组分析方法77-78
  • 4.3 低PH丙酸产甲烷菌群的驯化过程及筛选78-83
  • 4.3.1 步长为一个HRT降低pH并循环的丙酸产甲烷过程78-79
  • 4.3.2 步长为二个HRT降低pH的丙酸产甲烷过程79-80
  • 4.3.3 步长为三个HRT降低pH的丙酸产甲烷过程80-81
  • 4.3.4 步长为四个HRT降低pH的丙酸产甲烷过程81-82
  • 4.3.5 无逐步驯化直接降至目标pH的丙酸产甲烷过程82-83
  • 4.4 低PH丙酸产甲烷驯化体系内微生物群落分析83-89
  • 4.4.1 低pH丙酸产甲烷驯化体系内古菌群落演替规律83-85
  • 4.4.2 低pH丙酸产甲烷驯化体系内细菌群落演替规律85-88
  • 4.4.3 低pH丙酸产甲烷驯化体系内关键功能菌群分析88-89
  • 4.5 本章小结89-91
  • 第五章 促进酸败发酵体系恢复的生物强化作用及微生物分析91-108
  • 5.1 引言91
  • 5.2 材料及方法91-93
  • 5.2.1 接种物及原料91-92
  • 5.2.2 生物强化菌剂92
  • 5.2.3 实验装置及实验设计92
  • 5.2.4 厌氧发酵性能分析方法92-93
  • 5.2.5 宏基因组分析方法93
  • 5.3 生物强化对酸败发酵体系的恢复作用93-95
  • 5.3.1 有机负荷过载对厌氧发酵性能的影响93
  • 5.3.2 生物强化对酸败厌氧发酵体系的影响93-95
  • 5.4 生物强化对的微生物群落演替的影响95-100
  • 5.4.1 生物强化对微生物古菌群落演替的影响95-97
  • 5.4.2 生物强化对微生物细菌群落演替的影响97-100
  • 5.5 生物强化对微生物网络关系的影响100-102
  • 5.5.1 投加菌液对发酵体系微生物网络关系的影响100-101
  • 5.5.2 投加灭菌菌液的对发酵体系微生物网络关系101-102
  • 5.6 生物强化对微生物基因功能的影响102-107
  • 5.6.1 生物强化对细菌基因功能的影响102-105
  • 5.6.2 生物强化对古菌基因功能的影响105-107
  • 5.7 本章小结107-108
  • 第六章 氨对丙酸产甲烷过程的影响及微生物群落分析108-118
  • 6.1 引言108
  • 6.2 实验材料及方法108-110
  • 6.2.1 接种物及培养基108-109
  • 6.2.2 实验装置109
  • 6.2.3 实验设计及操作109
  • 6.2.4 厌氧发酵性能分析方法109
  • 6.2.5 宏基因组分析方法109-110
  • 6.3 氨对丙酸厌氧发酵性能的影响110-111
  • 6.4 氨对丙酸厌氧发酵过程中物质平衡的影响111-113
  • 6.5 氨对丙酸厌氧发酵中古菌群落演替的影响113-114
  • 6.6 氨对丙酸厌氧发酵中细菌群落演替的影响114-115
  • 6.7 氨对丙酸厌氧发酵过程中功能菌群丰度的影响115-117
  • 6.8 本章小结117-118
  • 第七章 缓解氨抑制的生物强化作用及微生物分析118-129
  • 7.1 引言118-119
  • 7.2 材料和方法119-121
  • 7.2.1 接种物和生物强化菌剂119
  • 7.2.2 实验搭建及设计119-120
  • 7.2.3 发酵性能分析方法120
  • 7.2.4 荧光原位杂交120-121
  • 7.3 生物强化对氨抑制发酵性能的影响121-124
  • 7.4 生物强化效率124-126
  • 7.5 FISH探测关键功能菌126-127
  • 7.6 本章小结127-129
  • 第八章 结论与建议129-132
  • 8.1 主要结论129-130
  • 8.2 创新点130
  • 8.3 进一步研究建议130-132
  • 参考文献132-144
  • 致谢144-145
  • 作者简介145

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