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《中国农业大学》 2017年
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石灰性潮土N_2O产生过程及相关功能基因丰度和表达

杨柳青  
【摘要】:深刻理解农田土壤N_2O产生过程及机制对于提出有针对性的减排N_2O措施至关重要。关于土壤N_2O排放通量、土壤微生物中氨氧化细菌和古菌的丰度已有了大量研究,但是将田间N_2O排放、田间原位土壤硝化-反硝化功能基因丰度、田间土壤环境联系到一起的研究还不够深入,华北平原石灰性潮土的研究现状也是如此。为更加深刻理解华北平原石灰性潮土N_2O排放过程和机制,本研究基于一个田间长期定位试验,原位监测N_2O排放通量,原位取土提取土壤DNA,对总菌以及硝化-反硝化过程中的相关功能基因(16SrRNA、编码氨单加氧酶的amoA、硝酸盐还原酶narG、亚硝酸盐还原酶nirS和nirK、N_2O还原酶nosZ基因)进行定量,分析N_2O排放通量、N_2O年排放量、土壤理化性质、功能基因丰度之间的关系,解释该地区施肥事件后土壤强N_2O排放和降水或灌溉后的弱N_2O峰的产生机制;为更加深刻理解田间N_2O的产生过程及主要控制因素,设置不同的碳氮添加和不同初始O_2浓度,结合全自动采样培养系统(Robot系统)和分子生物学技术,实时测定培养瓶内O_2、CO_2、NO、N_2O和N_2动态变化。测定气体的同时设定平行组,用于测定土壤NH4+、N_2O-、NO3-、pH、土壤含水量等性质,提取土壤RNA,反转录合成cDNA,分析在O_2浓度不断下降的过程中土壤氮素和功能基因转录数变化动态。主要研究结果如下:(1)长期施用尿素和/或有机肥显著增加了土壤中氨氧化细菌(AOB)的数量,其每克干土拷贝数在1.4e+7至1.9e+7范围内。施肥事件增加了施肥处理Nopt(施用化肥,玉米和小麦秸秆均不还田,施化肥量根据优化Nmin(NO3-+NH4+)测试)、CNopt(化肥施用和Nopt相同,玉米和小麦秸秆还田)和CM(施用牛粪的同时根据氮平衡计算,不足的氮用化肥补充,玉米和小麦秸秆均还田)的AOB数量,与施肥前相比,分别增加了 14.7%、124.5%和107.6%,从而导致了施肥后近一周的强N_2O排放;长期秸秆还田和施用有机肥增加了土壤中反硝化菌的数量,尤其是有机肥CM处理;年N_2O排放量和反硝化基因narG、nirS和nirK丰度之间有显著的正相关(P0.05),说明在适合反硝化作用发生的条件下这些基因的丰度和N_2O排放相关;尽管nosZ基因拷贝数也有所增加,但是其将N_2O还原为N_2的效果被以上反硝化基因拷贝数增加造成的N_2O排放增加部分抵消;由amoA基因拷贝数增加导致的施肥后的强N_2O排放峰和与反硝化基因丰度有关的弱N_2O排放峰共同贡献了该土壤的年N_2O排放。(2)初始O_2浓度为21%和3%的加铵处理(AS60,AS200)促进了土壤氨氧化过程,增加了土壤中amoA基因转录数,加大了 O_2的消耗速率,产生大量N_2O,同时累积NO_2-。随着培养瓶内的O_2不断被消耗至2%以下,土壤中反硝化基因转录数开始变大,反硝化作用开始启动,瓶内N_2O浓度继续升高;初始O_2浓度为0%时,培养瓶内主要发生的是反硝化作用,但是在高铵和高硝的浓度下,反硝化作用有被抑制的迹象;当初始O_2浓度为21%和3%时,硝化抑制剂处理中C2H2抑制了氨氧化作用,显著减少了 N_2O的排放,同时避免了NO_2-的累积,但是没有阻断NH4+向NO3-的转化,只是降低了该过程的转化速率;葡萄糖的加入显著增加了土壤nosZ基因的转录数,促进了 N_2O向N_2的转化,N_2的排放量显著高于其他处理;在好氧的条件下(21%-3%),该类型土壤中NH4+含量很低时,即使土壤内有大量的硝酸盐,也不会发生NO3-的还原,也不会有N_2O的排放;而在厌氧条件下,土壤内NH4+浓度基本保持恒定,但是在培养中后期,初始O_2浓度为21%和3%的条件下各处理都出现了不同程度的NH4+浓度的上升和NO3-浓度的下降,可能发生了DNRA(硝酸盐的异化还原)过程。(3)随着O_2的不断消耗,N_2O/(NO+N_2O+N_2)产物比整体呈现上升的趋势。加铵处理混合过程中的N_2O/(NO+N_2O+N_2)产物比在28%至62%之间,且初始O_2浓度为3%的N_2O产物比大于初始O_2浓度为21%的条件。加碳则促进了土壤中N_2O向N_2的转化,将N_2O产物比降为1.7%至3.5%;Spearman相关性分析发现气体产物NO、N_2O、N_2浓度、N_2O产物比及反硝化基因(nirS和nosZ)转录数与O_2浓度之间呈现显著的负相关(P0.01)。(4)不同处理在O_2浓度变化过程中,细菌群落构成有一定的变化。但是,由于硝化-反硝化菌在土壤中的丰度太低,在门水平并没有找到与硝化-反硝化作用密切相关的细菌种群的变化。综上所述,长期的施肥会增大土壤内的硝化-反硝化功能基因丰度。当外界施肥事件发生时,土壤中硝化作用基因发挥作用引起强烈的氨氧化作用,造成该地区施肥后的强N_2O排放;氨氧化菌的强烈活动导致了土壤O_2浓度降低,可能启动低氧和厌氧条件下发生的硝化细菌的反硝化作用或反硝化作用。本研究探索了 O_2浓度变化与硝化-反硝化过程中的气体变化动态、土壤氮素变化动态和基因转录数之间的关系,发现了 O_2浓度与硝化-反硝化过程中的气态产物以及相关基因转录数之间的相关性;但是,单单考虑O_2浓度是不够的,某一时刻的N_2O排放过程同时受O_2浓度和基质浓度的共同控制。在本研究土壤中,使用硝化抑制剂避免局部高铵浓度下引起强氨氧化作用引起土壤微域厌氧触发反硝化过程这一链锁反应是减少N_2O排放的重要途径。
【学位授予单位】:中国农业大学
【学位级别】:博士
【学位授予年份】:2017
【分类号】:S154.1;Q78

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