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《中国农业大学》 2017年
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天津地区PRRSV类NADC30毒株的监测、分离毒株的基因组特征与致病性分析

孙英峰  
【摘要】:猪繁殖与呼吸综合征(PRRS)是由猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)引起的一种严重影响生猪产业的重要病毒性疫病。近年来,我国陆续报道PRRSV类NADC30毒株的流行,给猪场PRRS防控带来新的挑战。本研究对天津地区猪场PRRSV类NADC30毒株的感染情况进行了监测,分析了分离毒株的基因组特征以及致病性,并评价了现有疫苗对分离毒株攻毒的免疫保护效力,以期了解天津地区PRRSV类NADC30毒株的流行状况,为PRRSV类NADC30的防控提供依据。基于PRRSV类NADC30毒株Nsp2基因缺失的特性,建立了区分PRRSV经典毒株、高致病性毒株(HP-PRRSV)和类NADC30毒株的RT-PCR鉴别检测方法。对2014-2016年天津地区63个猪场396份临床样本进行了检测,结果表明,PRRSV阳性检出率为26.26%(104/396),其中HP-PRRSV阳性率为69.23%(72/104),PRRSV经典毒株阳性率为4.81%(5/104),类NADC30阳性率为25.96%(27/104)。2014-2016年类NADC30毒株年度阳性率依次为6.25%、17.07%和58.06%,提示类NADC30毒株感染呈现增高趋势。对扩增的Nsp2基因的变异分析表明,NADC30阳性样品中的13份样本除具有131个特征性氨基酸缺失外,还存在2个氨基酸缺失。3份阳性样品的ORF5存在1个氨基酸缺失,类NADC30毒株的Nsp2、ORF5变异呈现多样化。结合猪场使用PRRSV疫苗免疫的调查,结果显示,免疫经典PRRSV疫苗(MLV-VR2332株、CH-1R株、R98株)和HP-PRRSV减毒活疫苗(TJm-F92株、JXA1-R株)的猪场均发生类NADC30毒株感染。采用MARC-145细胞系从PRRSV类NADC30阳性样本中分离病毒,经IFA和RT-PCR鉴定,共分离到 7 株 PRRSV,分别命名为 TJnh1401、TJnh1501、TJnh1502、TJdg1601、TJdg1602、TJbd1601和TJbd1602。结合Nsp2和ORF5序列分析结果,选取分离毒株TJnh1501进行蚀斑纯化和全基因组序列测定。结果显示,分离毒株TJnh1501在MARC-145细胞上的病毒滴度可达107.0TCID50;其全基因组序列与NADC30毒株同源性仅为86.6%,而与HP-PRRSV毒株的同源性达96.3%,且Nsp2具有NADC30毒株131个氨基酸缺失的分子特征;应用SimPlot生物学软件的分析结果表明,TJnh1501为HP-PRRSV疫苗毒株与NADC30毒株的重组病毒,重组位置位于非结构蛋白编码区(Nsp2)的1737nt-3506nt。分析了 TJnh1501对健康仔猪的致病性。结果显示,TJnh1501感染仔猪呈现体温升高、精神沉郁、呼吸困难、流鼻涕和日增重下降的临床症状;感染仔猪的肺脏水肿、实变,肺支气管周边炎性细胞浸润、支气管黏膜上皮脱落、血管内瘀血,感染组仔猪肺脏评分显著高于对照组(p0.05)。由此表明,重组病毒TJnh1501对仔猪具有一定的致病力。进一步评价了现有商品化PRRSV疫苗对分离毒株TJnh1501的免疫保护效果。结果显示,MLV Inglevac PRRS(?)和HP-PRRSV减毒活疫苗JXA1-R株免疫仔猪不能抵抗TJnh1501的攻击,表明这两种疫苗对分离毒株TJnh1501的感染不能提供有效的免疫保护。
【关键词】:猪繁殖与呼吸综合征病毒 类NADC30毒株 监测 病毒分离 基因组特征 致病性
【学位授予单位】:中国农业大学
【学位级别】:博士
【学位授予年份】:2017
【分类号】:S852.65
【目录】:
  • 摘要3-4
  • Abstract4-11
  • 缩略词表11-12
  • 第一章 引言12-18
  • 1.1 国内外研究现状12-14
  • 1.2 研究的目与意义14
  • 1.3 研究内容与技术路线14-17
  • 1.3.1 研究内容14
  • 1.3.2 技术路线14-17
  • 1.4 研究目标17-18
  • 第二章 2014-2016年天津地区PRRSV类NADC30毒株的监测18-36
  • 2.1 引言18
  • 2.2 材料与方法18-24
  • 2.2.1 材料18-22
  • 2.2.2 方法22-24
  • 2.3 结果与分析24-34
  • 2.3.1 RT-PCR鉴别检测方法的反应体系优化结果24-25
  • 2.3.2 RT-PCR鉴别检测方法的特异性试验结果25
  • 2.3.3 RT-PCR鉴别检测方法的敏感性试验结果25-26
  • 2.3.4 RT-PCR鉴别检测方法的PCR产物测序鉴定26
  • 2.3.5 区分经典、HP和类NADC30 PRRSV的RT-PCR临床样品检测结果26-28
  • 2.3.6 PRRSV类NADC30临床样本Nsp2基因序列测定和同源性分析28-30
  • 2.3.7 基于Nsp2高变区核苷酸序列遗传进化分析30-31
  • 2.3.8 PRRSV类NADC30临床样本ORF5基因序测定和同源性分析31-32
  • 2.3.9 基于ORF5核苷酸序列遗传进化分析32
  • 2.3.10 ORF5糖基化位点分析32-34
  • 2.4 讨论34-35
  • 2.5 小结35-36
  • 第三章 PRRSV类NADC30毒株分离鉴定及基因组特征分析36-54
  • 3.1 引言36-37
  • 3.2 材料与方法37-42
  • 3.2.1 材料37-38
  • 3.2.2 方法38-42
  • 3.3 结果与分析42-52
  • 3.3.1 PRRSV类NADC30毒株分离结果42
  • 3.3.2 细胞培养物间接免疫荧光检测42-43
  • 3.3.3 细胞培养物的RT-PCR检测结果43-44
  • 3.3.4 分离毒株TJnh501蚀斑纯化试验结果44
  • 3.3.5 分离毒株TJnh501在MARC-145细胞增殖规律44
  • 3.3.6 分毒毒株TJnh1501全基因组扩增44-45
  • 3.3.7 分离毒株TJnh1501基因测序与拼接45-46
  • 3.3.8 分离毒株TJnh1501全基因组序列分析46-52
  • 3.4 讨论52-53
  • 3.5 小结53-54
  • 第四章 PRRSV类NADC30重组病毒TJnh1501致病性分析54-64
  • 4.1 引言54
  • 4.2 材料与方法54-58
  • 4.2.1 材料54-55
  • 4.2.2 方法55-58
  • 4.3 结果与分析58-62
  • 4.3.1 体温动态变化58
  • 4.3.2 临床症状评分58-59
  • 4.3.3 日增重变化59-60
  • 4.3.4 血清中病毒滴度60
  • 4.3.5 血清中N蛋白抗体水平60-61
  • 4.3.6 肺脏大体病变及评分61
  • 4.3.7 肺脏显微组织病变及评分61-62
  • 4.4 讨论62-63
  • 4.5 小结63-64
  • 第五章 PRRSV疫苗对重组病毒TJnh1501的免疫保护效果分析64-74
  • 5.1 引言64
  • 5.2 材料与方法64-66
  • 5.2.1 材料64-65
  • 5.2.2 方法65-66
  • 5.3 结果与分析66-73
  • 5.3.1 体温动态变化66
  • 5.3.2 临床症状及评分66-67
  • 5.3.3 日增重分析67-68
  • 5.3.4 血清中病毒滴度68-69
  • 5.3.5 血清N蛋白抗体水平69-70
  • 5.3.6 大体剖检病变及评分70-71
  • 5.3.7 显微组织病变及评分71-73
  • 5.4 讨论73
  • 5.5 小结73-74
  • 第六章 结论74-75
  • 第七章 创新点75-76
  • 第八章 文献综述 我国PRRSV变异与毒株多样性76-82
  • 8.1 PRRSV病原学研究76
  • 8.2 我国PRRSV的变异与演化76-78
  • 8.3 PRRSV变异与演化的分子机制78-79
  • 8.4 PRRSV变异与致病性79-80
  • 8.5 展望80-82
  • 参考文献82-88
  • 致谢88-90
  • 个人简介90

【参考文献】
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