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《中国农业大学》 2017年
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LH诱导类表皮生长因子表达及卵母细胞成熟的分子机制

王雅坤  
【摘要】:在排卵前卵泡中,钠肽受体2 (natriuretic peptide receptor 2, NPR2)通过与其配体C型钠肽(natriuretic peptide C, NPPC)结合,维持卵母细胞减数分裂阻滞。来自垂体的黄体生成素(luteinizing hormone, LH)诱导类表皮生长因子(epidermal growth factor-like factors, EGF-like factors)表达,激活表皮生长因子受体(EGF receptor,EGFR)信号,促进卵母细胞减数分裂恢复以及排卵。本研究探讨了 LH诱导类表皮生长因子表达的分子机制,以及激活的EGFR信号是否通过下调NPR2功能促进卵母细胞减数分裂恢复。研究发现,体内注射LH受体(LH receptor, LHR)激动剂人绒毛膜促性腺激素(human chorionic gonadotropin, hCG)1小时后,小鼠卵泡壁层颗粒细胞中的环磷腺苷效应元件结合蛋白(cAMP response element binding protein, CREB)被快速激活。在卵泡体外培养模型中,激活LHR同样可诱导壁层颗粒细胞中CREB磷酸化,并促进类表皮生长因子的表达、卵母细胞减数分裂恢复以及卵丘扩展。相反,CREB功能复合物形成抑制剂KG-501,可以逆转LH诱导的类表皮生长因子表达及卵母细胞减数分裂恢复。另外,在颗粒细胞体外培养模型中,利用Creb siRNA下调CREB蛋白水平,显著降低LH诱导的类表皮生长因子mRNA水平。进一步研究表明,丝裂原活化蛋白激酶(mitogen-activated protein kinase 3/1,MAPK3/1)抑制剂或蛋白激酶 B (protein kinase B,Akt)抑制剂都可抑制LH诱导的CREB磷酸化水平及类表皮生长因子的mRNA水平上调。因此,LH通过磷酸化MAPK3/1和Akt,激活壁层颗粒细胞中CREB,从而诱导类表皮生长因子表达。随后,卵丘细胞中EGFR信号被激活,并诱导卵母细胞减数分裂恢复。接下来,我们研究了 LH激活的EGFR信号是否通过下调NPR2功能诱导卵母细胞减数分裂恢复。体外培养卵丘卵母细胞复合物(cumulus-oocyte complexs, COCs),添加30 nMNPPC抑制卵母细胞自发成熟作为培养模型。在这个培养模型中,EGF可在培养4小时后诱导卵母细胞减数分裂恢复。进一步实验表明,EGF可上调卵丘细胞内钙离子(Ca2+)浓度,并下调卵丘细胞和卵母细胞内的环磷酸鸟苷(cyclic guanosine monophosphate, cGMP)浓度。另外,Ca2+激动剂鞘氨醇-1-磷酸(sphingosine-1-phosphate, S1P)可以模拟EGF诱导的Ca2+浓度上调和卵母细胞减数分裂恢复。而EGFR抑制剂AG1478和Ca2+螯合剂BAPTA/AM,都可抑制EGF下调的cGMP水平及卵母细胞减数分裂恢复。同时,EGF也可下调卵丘细胞中Npr2mRNA水平,但这一作用可能并不参与卵母细胞减数分裂的恢复,因为利用放线菌酮(CHX)抑制NPR2蛋白的从头合成对NPPC和EGF调控的卵母细胞成熟并无影响。然而,EGF对cGMP类似物维持的卵母细胞减数分裂阻滞并没有作用。因此,EGFR信号依赖的Ca2+信号抑制了卵丘细胞中NPR2鸟苷酸环化酶活性,诱导卵母细胞减数分裂恢复。另外,LH激活的EGFR信号在诱导卵母细胞减数分裂恢复的同时,也诱导卵泡腔发生扩张,而这一扩张对排卵至关重要。以上实验结果表明,LH通过磷酸化MAPK3/1和Akt,激活壁层颗粒细胞中CREB,从而诱 ,导类表皮生长因子的表达。随后EGFR信号上调卵丘细胞中Ca2+浓度,下调NPR2鸟苷酸环化酶活性,从而诱导卵母细胞减数分裂恢复。
【学位授予单位】:中国农业大学
【学位级别】:博士
【学位授予年份】:2017
【分类号】:Q132

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