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《中国农业大学》 2018年
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双加氧酶Tet对DNA甲基化修饰的影响及相关调控机制研究

王倩倩  
【摘要】:DNA甲基化作为哺乳动物中重要的表观遗传修饰,参与了染色质结构调控以及基因表达等多种生命活动。最常见的DNA甲基化修饰形式为5-甲基胞嘧啶(5-methylcytosine,5mC)。DNA的甲基化由DNA甲基转移酶(DNA methyltransferase,Dnmts)建立并维持,而去甲基化过程近几年才被广泛认知并研究。10-11易位甲基胞嘧啶双加氧酶(ten-eleven translocation,Tet)蛋白家族可催化5mC发生连续氧化,逐步生成5-羟甲基胞嘧啶(5-Hydroxymethylcytosine,5hmC)、5-甲酰基胞嘧啶(5-formylcytosine,5fC)和 5-羧基胞嘧啶(5-carboxylcytosine,5caC),并最终将其从DNA上移除,恢复为非甲基化的胞嘧啶。在胚胎着床前的发育过程中,Tet3在卵母细胞及受精卵中特异性高表达,并介导了父本DNA甲基化的去除,而Tet1和Tet2在胚胎发育后期才开始表达。随着对Tet蛋白不断深入的研究发现,Tet对DNA甲基化修饰的调控是一个复杂的过程,而目前对于Tet蛋白的研究还非常有限,Tet家族三种蛋白对胚胎发育的作用有何差异还尚不明确,Tet对胚胎中的父本DNA、母本DNA以及体细胞DNA的影响和作用机制的区别等很多问题还有待进一步研究。针对上述相关问题,本论文进行了如下研究。为了研究Stella在体细胞中的作用,使用HeLa细胞建立了稳定表达Stella的细胞系,并在该细胞系中瞬时转染Tet3,通过免疫荧光染色及Dot-blot检测发现,Stella仅对Tet3的活性具有抑制作用,而无法抑制Tet1及Tet2的活性。为了降低细胞中H3K9二甲基化修饰(H3K9dimethylation,H3K9me2)的水平,使用组蛋白甲基转移酶抑制剂UNC0638处理细胞,免疫荧光染色检测发现体细胞中H3K9me2水平的降低并不影响外源Stella对Tet3的抑制作用。通过使用UNC0638处理供体细胞,并进行体细胞核移植发现,克隆胚胎中H3K9me2修饰水平的降低同样不影响内源性的Stella在细胞核中的分布以及胚胎发育过程中5hmC的生成。而co-IP的结果进一步表明,Stella无法结合体细胞中H3K9me2修饰的组蛋白,但却与Tet3具有相互作用,且H3K9me2水平并不影响Stella与Tet3的相互作用强度,表明体细胞核移植胚胎与受精卵不同,Stella不必与H3K9me2结合,可直接与Tet3相互作用来抑制其双加氧酶的活性。与此同时,co-IP的结果表明Stella与Tet1及Tet2并无相互作用。为了研究Tet1及Tet2在受精卵中的作用,在早期受精卵中注射Tet1及Tet2的mRNA,通过免疫荧光染色发现Tet1及Tet2均可导致父本及母本DNA的5hmC水平显著升高,但5mC的荧光水平并无显著差异。为了进一步研究Tet1及Tet2对DNA甲基化修饰的影响,对注射GFP、Tet1及Tet2 mRNA的受精卵及配子进行单细胞甲基化测序,并利用双亲的单核苷酸多态性(Single nucleotide polymorphisms,SNPs)位点来区分父本及母本DNA,结果表明Tet1及Tet2均可导致父本及母本DNA的平均甲基化水平进一步降低,与此同时,某些位点的甲基化修饰有所升高。在父本及母本基因组中,Tet1及Tet2均存在各自特异性的靶位点。通过对胚胎进行体外培养发现在1细胞期过表达外源Tet1会抑制胚胎从桑葚胚到囊胚的发育过程,Tet2的过表达则影响胚胎从2细胞分裂到4细胞的过程,Tet1及Tet2的过表达均可导致胚胎质量的下降。以上结果表明Tet1及Tet2会导致受精卵DNA甲基化修饰出现异常,并影响胚胎的正常发育。此外,通过对受精卵及配子的甲基化测序结果进行比较发现,受精后父本DNA发生了广泛而剧烈的去甲基化,但仍有部分位点的甲基化水平升高;而对于母本DNA,虽然平均甲基化水平并未发生明显变化,但其并非处于静止状态,母本DNA的甲基化修饰仍发生了动态变化,表明受精卵中双亲DNA均经历着甲基化的去除和甲基化的产生。为了进一步研究Tet蛋白介导的5hmC和5mC的生成机制,利用“Tet-on advanced”系统在HEK293细胞中建立了可诱导表达Tet3的细胞系。免疫荧光染色、LC-MS等检测结果表明,Tet3的稳定表达可导致细胞中的总体5hmC及5mC水平同时升高,而停止Tet3的表达后,5hmC 水平的降低也伴随着5mC水平的下降。对H19基因启动子区的检测同样表明Tet3可导致特定位点的5hmC及5mC 水平同时升高。利用ELISA对细胞中DNA甲基转移酶活性的检测表明Tet3的过表达可提高细胞中DNMTs的活性,而co-IP的进一步检测则证实了 Tet3与内源DNMT1、DNMT3A及DNMT3B均存在相互作用。以上结果暗示Tet3可能会通过与DNMT1、DNMT3A及DNMT3B相互作用而提高其DNA甲基转移酶的活性,进而在Tet3催化5mC去除的的同时DNMTs也产生了新的5mC修饰。综上所述,体细胞或克隆胚胎中Stella与Tet3的相互作用不依赖于H3K9me2修饰;Stella对Tet1及Tet2无抑制作用,Tet1及Tet2的过表达导致受精卵中DNA甲基化修饰的异常从而影响胚胎的发育;受精后,DNA去甲基化过程与甲基化过程同时存在;Tet3可与DNMTs相互作用并促进其甲基转移酶活性,因此Tet3可能参与了受精卵DNA的甲基化过程。本研究对进一步了解受精卵及克隆胚胎发育过程中的DNA甲基化重编程机制具有参考意义,同时为阐明Tet蛋白对DNA修饰的分子机制提供了新的理论依据。
【学位授予单位】:中国农业大学
【学位级别】:博士
【学位授予年份】:2018
【分类号】:Q75

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