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《中国农业大学》 2018年
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Development of FICA and UPLC-MS/MS for Simultaneous Determination of Aflatoxin B1 and Zearalenone in Chinese Herbal Medicines

孙淑娟  
【摘要】:畜禽养殖业中抗生素长期不规范使用导致残留和细菌耐药性问题十分突出,严重威胁人类健康。中草药以其低毒、低残留和不易诱导耐药性等特点越来越广泛应用于动物生长性能改善和疾病预防治疗。但是,中草药在其生长、加工、运输、储藏过程中,极易发生霉变,产生真菌毒素,如黄曲霉毒素、玉米赤霉烯酮等,这些毒素具有潜在的“三致”作用,严重威胁动物安全。加强对中草药中真菌毒素检测是保障中草药质量安全的重要手段。本文旨在建立同时检测中草药中多类真菌毒素的荧光免疫层析方法(FICA)和超高效液相色谱串联质谱方法(UPLC-MS/MS),以期为中草药的安全使用提供技术支撑。通过优化荧光背板、反应体系pH、抗原和抗体的用量、孵育时间和显色时间等条件,成功建立了同时检测中草药中黄曲霉毒素B1(AFB1)和玉米赤霉烯酮(ZEN)的背景荧光免疫层析方法。方法对AFB1和ZEN的半数抑制率(IC50)分别为0.0192 ng/mL和0.61 ng/mL,cut-off值分别为0.1ng/mL和2ng/mL。在薏苡仁、山药和桔梗样本中,AFB1的检测限(LOD)均为0.38μg/kg,添加0.5、1、1.5 μg/kg,平均回收率在72.7%-88.0%之间,变异系数小于9.4%;ZEN的LOD均为10 μg/kg,添加10、30、50 μg/kg,平均回收率在74.9%-90.2%之间,变异系数小于8.9%。产品稳定性结果表明,该试纸条在室温下至少可保存12个月。通过优化微球、抗原和抗体用量、反应缓冲体系、检测模式、孵育时间和显色时间等条件,成功建立了同时检测中草药中AFB1和ZEN的时间分辨荧光免疫层析方法。方法对AFB1和ZEN的IC50 分别为 0.039 ng/mL 和 0.018 ng/mL,cut-off 值分别为 0.1 ng/mL 和 0.05 ng/mL。在薏苡仁、山药和桔梗样本中,AFB1的LOD均为0.60 μg/kg,添加1、2、3 μg/kg,平均回收率在73.0%-95.0%之间,变异系数小于9.5%;ZEN的LOD均为0.40 μg/kg,添加0.4、0.8、1.2μg/kg,平均回收率在75.8%-90.0%之间,变异系数小于11.3%。产品稳定性结果表明,该试纸条在室温下至少可保存12个月。成功建立了基于免疫亲和柱(IAC)净化的同时检测中草药中AFB1和ZEN的UPLC-MS/MS方法。以NHS-Sepharose4B为载体,分别与AFB1和ZEN的抗体进行偶联制备免疫亲和柱,优化了免疫亲和柱制备、上样洗脱等条件。在薏苡仁、山药和桔梗样本中,AFB1的LOD均为0.03μg/kg,添加0.1、0.5、μg/kg,平均回收率在80.3%-98.1%之间,变异系数小于13.2%;ZEN的LOD均为0.05 μg/kg,添加0.15、0.75、1.5μg/kg,平均回收率在73.2%-92.8%之间,变异系数小于12.8%。将方法用于实际样品检测,检测结果与荧光免疫层析方法结果进行比较,一致性良好,满足同时检测AFB1和ZEN的要求。综上所述,本文建立的同时检测中草药中AFB1和ZEN的FICA和基于免疫亲和柱净化的UPLC-MS/MS方法,具有灵敏、准确、简便等特点,满足国家相关检测要求,可用于实际样品中多类真菌毒素的筛查和确证。
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