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《中国农业大学》 2003年
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链霉菌高产木聚糖酶及其酶学性质的研究

丁长河  
【摘要】: 微生物木聚糖酶可以广泛地应用于纸浆生物漂白、功能性低聚木糖制造、面团改良剂和饲料添加剂等。本论文在国内首先筛选和鉴定了一株高产木聚糖酶的卷须链霉菌菌株(Streptomyces cirratus D-10),并研究了诱变和优化产酶条件对产酶的影响,进而对其木聚糖酶进行了纯化和酶学性质的研究。另外,还对橄榄绿链霉菌(Streptomycesolivaceoviridis E-86)的产酶条件进行了优化和中试实验。得到的主要内容和结论如下: 1.通过平板筛选和摇瓶复筛,从土壤中筛选出一株高产木聚糖酶菌株。经形态特征、细胞壁组分分析、培养特征和生理生化特征实验结果分析,该菌株鉴定为卷须链霉菌(Streptomyces cirratus D-10)。 2.采用紫外线和甲基磺酸乙酯(EMS)对卷须链霉菌(Streptomyces cirratus D-10)进行菌种诱变,经诱变处理后,在青霉素抗性平板上筛选得到多株高产木聚糖酶变异株。 经摇瓶实验,卷须链霉菌最佳的发酵产酶条件为:最适初始pH6.0,玉米芯水不溶木聚糖为碳源,胰蛋白胨为氮源,添加0.5%吐温80。在这样的发酵条件下,发酵液最高单位木聚糖酶酶活达到623 u/mL,是国内已报道的液体发酵最高木聚糖酶酶活。 本文还对卷须链霉菌高产木聚糖酶的机理进行了探讨,认为玉米芯水不溶木聚糖因为被木聚糖酶分解的速度较慢从而诱导产酶较多;吐温80因为影响细胞脂代谢、改变细胞膜的组成和结构而促进木聚糖酶的产生。 3.卷须链霉菌粗酶经过硫酸铵分级沉淀后酶活回收率为63.5%,酶纯化倍数为2.7倍。经过Q-sephrose FF离子交换层析,得到分子量为22.0 KDa电泳纯的木聚糖酶,其酶活回收率为24%,纯化倍数10倍。 4.卷须链霉菌(Streptomyces cirratus D-10)木聚糖酶纯酶酶反应的最适pH值为pH7.50。该酶在45℃条件下,在pH 3.10到pH 9.80之间酶活可保持90%木聚糖酶酶活。该酶最适反应温度为65℃,在50℃以下表现出很好的热稳定性。 在1mM浓度下,EDTA和SDS对酶活力影响很小;金属离子对纯酶活力抑制作用由强到弱依次为:Ag~+>Pb~(2+)、Mn~(2+)>Cu~(2+)、Co~(2+)>Ba~(2+)、Mg~(2+)、Ca~(2+)>Na~+、K~+、Zn~(2+);只有铁离子(Fe~(2+))可提高酶活力。 纯酶对不可溶性燕麦木聚糖、榉木木聚糖和桦木木聚糖表现较高酶活;其次为可溶性燕麦木聚糖;酶活最低的为自制的玉米芯木聚糖和棉子壳木聚糖。 5.橄榄绿链霉菌(Streptomyces olivaceoviridis E-86)摇瓶发酵最佳产酶条件为:最适初始pH值为pH6.0,玉米芯木聚糖和牛肉蛋白胨分别为碳源和氮源,添加1.5%的吐温80。在此条件下,木聚糖酶酶活达到1653 u/ml,是国际上已报道的链霉菌木聚糖酶的最高酶活。 5升发酵罐和200升中试发酵罐发酵产酶得到木聚糖酶最高酶活分别为540 u/ml和625u/ml。文献检索尚未见到200升及以上发酵罐条件下链霉菌发酵产木聚糖酶的报道。非变性聚丙烯酰铵梯度凝胶电泳(Native PAGE)和酶谱结果显示,橄榄绿链霉菌产木聚糖酶在非变性条件下,其活性酶蛋白分子量大约为750 KDa。这样高分子量的非变性蛋白也是首次报道。
【学位授予单位】:中国农业大学
【学位级别】:博士
【学位授予年份】:2003
【分类号】:TQ925

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