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《中国农业大学》 2003年
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转基因抗虫棉(Gossypium hirsutum L.)生产安全性的研究

芮玉奎  
【摘要】: 由于目前国内外尚没有关于转基因抗虫棉根际土壤毒蛋白在整个周年变化的动态的报道;尤其是国内外尚没有关于毒蛋白对根际土壤功能微生物和自身抗性物质变化趋势的系统报道。本论文从抗虫棉自身抗性物质含量的变化和调控研究了外源基因的转入及其表达对棉花自身的影响;通过检测转基因抗虫棉根际土壤毒蛋白的动态变化,进一步研究了Bt毒蛋白对根际土壤中固氮菌、有机磷细菌、无机磷细菌和钾细菌数量的影响,研究了转基因抗虫棉对土壤微生态的影响;为转基因抗虫棉容易缺钾、抗虫性与丰产性不协调等自身安全性和生态安全性提供理论根据。得出了以下结论: 1 根据豇豆胰蛋白酶抑制剂的高度保守性,从10个我国普遍栽培的豇豆品种中筛选出胰蛋白酶抑制剂活性最高的901青皮豇豆品种,提取豇豆胰蛋白酶抑制剂。首先用30%的饱和硫酸铵沉淀,去掉没有活性的残渣,将含有豇豆胰蛋白酶抑制剂的上清液再加入硫酸铵达60%的饱和度沉淀,将沉淀物收集,去掉无胰蛋白酶抑制剂活性的上清液通过以G-75为介质的凝胶过滤和以溴化氰活化的Sepherose4B(联有胰蛋白酶)亲和层析纯化了豇豆胰蛋白酶抑制剂(CpTI)并分多次多点免疫实验用兔制备了其兔多克隆抗体。用所制备的抗体建立了酶联免疫检测方法并检测了转CpTI基因棉花、水稻中的CpTI含量,稍微高于生物化学方法的测定结果,发现棉花不同器官CpTI的表达量不尽相同;抗体效价在10000以上,测定效果良好,标线规律,测定极限为4ng左右;与生物化学方法比较,本检测试剂盒误差较小,测定的结果准确,不受植物组织中色素的影响。本部分实验结果已在2003年3月通过农业部的专家鉴定,达到了国内领先、国际先进水平。 2 根据1999年Nature文章研究转Bt的玉米可以通过根系向土壤分泌毒蛋白,本文用酶联免疫检测技术(ELISA)研究了抗虫棉整个生育期土壤中的毒蛋白变化动态发现,转基因抗虫棉根际土壤中土壤中Bt毒蛋白含量明显高于常规棉根际土壤,一般抗虫棉高出常规棉200-300ng/g以上。甚至Bt毒蛋白含量最高时要比常规棉含量高一倍以上。经测定抗虫棉0-40cm土壤中毒蛋白含量以20cm处含量最高,所以土壤毒蛋白水平分布数据均选用20cm土壤测定。在盛蕾期距植株由近而远含量逐渐降低,后期有升高趋势,说明豇豆胰蛋白酶抑制剂的残留由幼嫩根系造成。CpTI的含量要比Bt毒蛋白的含量低一个数量级,一般在15ng/g左右。在棉花不同生育期,抗虫棉土壤中毒蛋白的含量变化规律比较明显,在植株毒蛋白表达量最高时土壤中的毒蛋白也达到最高峰。但是在棉花收获以后,土壤中的Bt毒蛋白降低到常规棉水平的50ng/g左右;而CpTI则降低到零,这说明外源毒蛋白的土壤残留不会对土壤造成长时间的影响。本部分实验在国内外的研究尚属首次。 3 鉴于有文献对毒蛋白在土壤中与土壤颗粒结合不易降解,但是受土壤pH值影响的报道,本文通过酶联免疫方法系统研究了Bt毒蛋白和CpTI在转基因抗虫棉整个生育期根际土壤中的降解情况。研究发现该两种毒蛋白在抗虫棉根际有不同程度的积累,但是豇豆胰蛋白酶抑制剂CpTI要比Bt毒蛋白少一个数量级;并且两种毒蛋白降解过程明显,Bt毒蛋白在盛蕾期到棉铃发育期之间毒蛋白降解速度加快,最快时达到4ng/g.hr;但是到吐絮期以后毒蛋白的降解明显放慢,降低几十倍,降解速度不到0.2ng/g.hr。用缩节安(DPC)处理以后毒蛋白的积累量有升高趋势,但 是对毒蛋白的降解速度没有造成明显影响。由以上结果可以得出毒蛋白的降解与温度、士壤含水 量和外源毒蛋白的浓度有密切关系。 4 抗虫棉根际土壤中固氮菌、钾细菌、无机磷细菌和有机磷细菌数量均明显低于常规棉,并且 其减少程度与根际土壤中Bt毒蛋白的含量呈一定程度的负相关,即根际土壤中毒蛋白的含量越 高、细菌的数量越低;到了第二年棉花种植前,常规棉与抗虫棉固氮菌、钾细菌、无机磷细菌和 有机磷细菌数量相差不大;经过DPC调控以后,没有明显的规律。经过研究Bt毒蛋白标准样品 对土壤中上述细菌的影响只有达到50nrt以上时才会对常规棉根际土壤中上述细菌的数量产生 明显的影响:而抗虫棉根际土壤中毒蛋白的数量仅在 200-300nglg之间,所以土壤中的细菌数量 不仅仅是有Bt毒蛋白一个因素,它还会受到土壤中其它的环境因素(如温度、土壤湿度和土壤 其它微生物)和植物根系活动(根系分泌物、根系脱落物)的影响;而细菌数量与毒蛋白呈正相 关,可能是毒蛋白会影响上述因素。到第二年棉花种植前,上述细菌的数量又恢复到与常规棉相 同的水平,证明了转基因抗虫棉对土壤的影响确实不会对土壤造成长时间的影响,但是会对当茬 作物造成不利的影响. 5 经过研究抗虫棉与常规棉各器官,尤其是根系中棉酚和缩合单宁含量后期大幅度升高;抗虫 棉缩合单宁含量在棉花生育前期高于常规棉、后期低于常规棉;抗虫棉器官中棉酚含量在整个生 育期都高于常规棉,这会严重影响棉花的生长发育(沈仍愚,1990),可能是造成棉花前期生长缓 慢的重要原因:棉花缩合单宁后期大量上升,会增加棉花的抗病性,但是由于缩合单宁可以减弱 Bt毒蛋白的杀虫活性(郭予员,200),因而抗虫棉后期?
【学位授予单位】:中国农业大学
【学位级别】:博士
【学位授予年份】:2003
【分类号】:S562

【引证文献】
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1 王因霞;徐宝梁;张青文;马妍妍;;用转基因棉籽作平菇培养料时平菇主要害虫的发生动态[J];昆虫学报;2006年01期
【参考文献】
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1 段建真,郭素英;我国茶树生态研究的进展[J];茶业通报;1995年01期
2 赵小蓉,林启美,孙焱鑫,张有山,王幼姗;小麦根际与非根际解磷细菌的分布[J];华北农学报;2001年01期
3 于晓光,张德君,滕玉辉,贾景斌,张德志;火炬树单宁含量研究[J];吉林林学院学报;1994年03期
4 牟金明,李万辉,张凤霞,姜岩;根系分泌物及其作用[J];吉林农业大学学报;1996年04期
5 赵正金,张春云,张正民,马泽仁,邱家驯,张国政;大豆根际和根系提取液对种子发芽、出苗抑制效应的初步研究[J];江苏农业科学;2000年02期
6 潘武中,唐友斌,王以康,崔世明,范富龙,傅庭治,曹幼琴,秦小琼;尿囊素对土壤微生物的激活作用及其对农作物的增产效应初报[J];江苏农业科学;1994年03期
7 范俊岗;刺槐、国槐根际土壤中氨基酸和IAA的含量[J];辽宁大学学报(自然科学版);1994年03期
8 魏守军;宋小轩;陈建华;项时康;;棉花感染枯萎病后棉酚及PAL的变化[J];棉花学报;1992年01期
9 王保民,何钟佩,田晓莉;苏云金芽胞杆菌杀虫晶体蛋白CryIA单克隆抗体的制备及在转Bt基因棉毒蛋白检测上的应用(英文)[J];棉花学报;2000年01期
10 段留生,张一,何钟佩,翟志席;生长素和细胞分裂素对棉花幼苗根系顶端优势的调控作用[J];棉花学报;2001年06期
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1 董志强;Bt棉氮素代谢特征与丰产性抗虫性协同表达的化学调控[D];中国农业大学;2000年
【共引文献】
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1 董晓霞,郭洪海,孔令安,赵树慧;杂交酸模耐盐性鉴定的生理指标筛选[J];山东农业科学;1999年06期
2 柳展基,于翠梅,张月杰,李晓燕,刘世强;不同盐浓度下水稻胚性愈伤组织生理生化指标分析[J];山东农业科学;2000年03期
3 张学坤,王留明,王胜利,周玉,杨静;转Bt基因抗虫棉田2、3代棉铃虫防治指标研究[J];山东农业科学;2001年03期
4 李汝忠,沈法富,王宗文,王景会,刘承运,申贵芳;转Bt基因抗虫棉Bt基因表达的时空动态[J];山东农业科学;2002年02期
5 王芙蓉;张传云;刘国栋;刘任重;刘勤红;张军;;利用花粉管通道技术创造棉花变异种质及其SSR标记分析[J];山东农业科学;2006年01期
6 王鹏;赵强;刘蕾;;植物源抗虫基因在作物育种中的应用[J];山东农业科学;2007年02期
7 于雪云;扈进冬;杨合同;;木霉菌抗药性研究进展[J];山东农业科学;2007年06期
8 唐亮;张进忠;于萍萍;孙萍;;硅酸盐细菌的分离、纯化、鉴定及生物学特性研究[J];山东农业科学;2008年01期
9 司美茹;苏涛;李桂芝;;济宁市土壤放线菌资源调查研究[J];山东农业科学;2008年04期
10 姜涛;褚栋;姜德锋;陶云荔;刘国霞;范仲学;;烟粉虱刺吸诱导转Bt+CpTI基因棉苯丙氨酸解氨酶和氧保护酶系活性变化[J];山东农业科学;2009年10期
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1 陈淑芳;周舟;;渗透胁迫对黄瓜幼苗膜脂过氧化和渗透调节物质含量的影响[A];现代农业理论与实践——安徽现代农业博士科技论坛论文集[C];2007年
2 牟方生;毛正轩;张超;杨泽湖;龚一耘;;棉花抗虫核不育保持系的培育与应用研究[A];中国作物学会2006年学术年会论文集[C];2006年
3 常二华;杨建昌;;结实期氮磷营养水平对根系生理及养分吸收的影响[A];中国作物学会栽培专业委员会换届暨学术研讨会论文集[C];2007年
4 杨程;徐程扬;;根系分泌物及根际效应研究综述[A];第十届中国科协年会论文集(二)[C];2008年
5 计巧灵;刘亚萍;周小云;;氮离子束注入的春小麦幼苗对盐胁迫的反应[A];中国科协2005年学术年会论文集——核科技、核应用、核经济论坛[C];2005年
6 黄丛林;张大鹏;;植物激素的免疫组织化学定位的技术分析[A];中国科学技术协会第二届青年学术年会园艺学论文集[C];1995年
7 何晓明;林毓娥;陈清华;邓江明;;高温对黄瓜幼苗生长及有关生理指标的影响[A];中国园艺学会第四届青年学术讨论会论文集[C];2000年
8 雷建军;;抗虫基因工程及其在蔬菜育种上的应用[A];全国蔬菜遗传育种学术讨论会论文集[C];2002年
9 吴凤芝;焦晓丹;于锡宏;;苯丙烯酸对土培黄瓜幼苗抗氧化酶和脯氨酸含量的影响[A];中国园艺学会第六届青年学术讨论会论文集[C];2004年
10 吴雪霞;朱月林;朱为民;陈建林;;外源一氧化氮对NaCl胁迫下番茄幼苗生长和光合作用的影响[A];中国园艺学会第七届青年学术讨论会论文集[C];2006年
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2 王猛;马尾松抑制消减文库的构建及抗病性相关基因的克隆[D];中南林业科技大学;2010年
3 刘卫东;湖南假俭草遗传多样性、生理学特性及护坡性能研究[D];中南林业科技大学;2010年
4 戴开结;滇中云南松适应低磷环境的机理研究[D];中南林业科技大学;2006年
5 李坤;葡萄连作障碍机理及调控途径的研究[D];沈阳农业大学;2010年
6 杨素苗;灌溉方式对红富士苹果根系水分生理特性影响的研究[D];河北农业大学;2011年
7 苏长青;适合转基因抗虫水稻和棉花PCR检测标准质粒的构建及试用[D];中国农业科学院;2011年
8 刘坤;海岛棉ERF族B3和B1亚组转录因子基因的克隆与特征研究[D];中国农业科学院;2011年
9 樊华;栽培技术对新疆长期连作棉田生产力影响的研究[D];石河子大学;2009年
10 阮景军;苦荞麦胰蛋白酶抑制剂的分离纯化、基因克隆表达及其抗病虫害研究[D];四川农业大学;2011年
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1 邓雅丽;土壤中铁铝氧化物对Bt毒素吸附的影响[D];华中农业大学;2010年
2 胡雪;水稻根际促生菌的分离鉴定及其对水稻作用效果的研究[D];华中农业大学;2010年
3 王亚艺;水稻—油菜轮作中钾肥效应及作物—土壤体系钾素动态变化研究[D];华中农业大学;2010年
4 刘鑫;利用分子标记辅助选择培育和评价三种BT基因(CRY1AC、CRY1C~*和CRY2A~*)抗虫水稻[D];华中农业大学;2010年
5 丛胜波;斜纹夜蛾与转基因棉(Cry1Ac)的互作研究[D];华中农业大学;2010年
6 卢增斌;防治水稻螟虫单项技术措施的评价及储备技术—转基因水稻对非靶标生物影响的研究[D];华中农业大学;2010年
7 吴寿明;转基因抗虫棉单交种、三交种的优势分析[D];华中农业大学;2010年
8 卢小三;两个杨树无性系再生体系的建立及抗虫基因Cry1C+9C转化的初步研究[D];华中农业大学;2010年
9 郝艳;油茶林土壤微生物、酶活性研究及高效解磷菌的筛选[D];中南林业科技大学;2009年
10 王婧;不同类型种子吸湿解吸规律及其活力降低过程中的生理生化特性变化[D];山东农业大学;2010年
【同被引文献】
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1 杨磊,聂太礼,刘水仙,孙平秀,肖远龙;慈抗杂3号棉田靶标与非靶标昆虫的种群变动规律初探[J];江西棉花;2003年02期
2 崔金杰,夏敬源;麦套夏播转Bt基因棉R93-6对昆虫群落的影响[J];昆虫学报;2000年01期
3 邓曙东,徐静,张青文,周世文,徐冠军;转Bt基因棉对非靶标害虫及害虫天敌种群动态的影响[J];昆虫学报;2003年01期
4 孙长贵,张青文,徐静,王因霞,刘俊丽;转Bt基因棉和转Bt+CpTI双价基因棉对棉田主要害虫及其天敌种群动态的影响[J];昆虫学报;2003年06期
5 任璐,杨益众,李瑄,苗麟,余月书,秦启联;转基因抗虫棉对棉铃虫及其内寄生蜂的双重效应[J];昆虫学报;2004年01期
6 刘小侠,张青文,蔡青年,李建成,董杰;Bt杀虫蛋白对不同品系棉铃虫和中红侧沟茧蜂生长发育的影响[J];昆虫学报;2004年04期
7 宋天俊,吴洪兴,刘景珍;转基因抗虫棉发展现状及产业化[J];农业科技通讯;2004年09期
8 王风延,李瑞花,周兰英,于佃平,李军,李照会;转BT基因抗虫棉田昆虫种群动态及综合防治研究[J];莱阳农学院学报;2003年01期
9 张永军,郭予元;棉花缩合单宁和Bt杀虫蛋白的交互关系[J];棉花学报;2000年06期
10 崔金杰,夏敬源;麦套夏播转Bt基因棉田主要害虫及其天敌的发生规律[J];棉花学报;1998年05期
【二级引证文献】
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1 赵晓娜;化学杀虫剂对黑腹果蝇的毒力测定及对食用菌菌丝生长的影响[D];福建农林大学;2011年
2 穆洪雁;食用菌害虫优势种物理防治和生物防治技术的研究[D];山东农业大学;2012年
【二级参考文献】
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1 张小四,李松岗,许崇任,赵建周,赵奎军;转Bt棉不同生长期及不同器官杀虫蛋白表达量的免疫学方法测定[J];北京大学学报(自然科学版);2000年04期
2 杨朝辉,雷建军,曹必好,宋明,王亚培,王进;豇豆胰蛋白酶抑制剂基因的克隆[J];西北植物学报;2002年05期
3 康绍忠,张建华,梁宗锁,胡笑涛,蔡焕杰;控制性交替灌溉——一种新的农田节水调控思路[J];干旱地区农业研究;1997年01期
4 孟颂东,关桂兰,覃楠;PG1和PG6微生物在小麦根际的定殖对植物生长的影响[J];干旱区研究;1995年03期
5 秦新民,邓智年;一种简便、快捷的胰蛋白酶抑制剂基因的分离与克隆方法[J];广西植物;2002年05期
6 孙文浩,俞子文,余叔文;城市富营养化水域的生物治理和凤眼莲抑制藻类生长的机理[J];环境科学学报;1989年02期
7 涂书新,郭智芬,孙锦荷;富钾植物籽粒苋根系分泌物及其矿物释钾作用的研究[J];核农学报;1999年05期
8 谢道昕,范云六,倪万潮,黄骏麒;苏云金芽孢杆菌(Bacillus thuringiensis)杀虫晶体蛋白基因导入棉花获得转基因植株[J];中国科学(B辑 化学 生命科学 地学);1991年04期
9 毛慧珠,唐惕,曹湘玲,白永延,郭培福,符文俊;抗虫转基因甘蓝及其后代的研究[J];中国科学C辑:生命科学;1996年04期
10 周音,张智奇,王少鸥,钟维瑾;十字花科植物基因技术研究进展及存在问题[J];吉林农业大学学报;1996年01期
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1 邢宏宜;易永华;赵俊兴;吴宗利;贾涛;王成;马卫平;;转基因抗虫棉新品种陕204[J];农业科技通讯;2007年12期
2 李承道;;发展抗虫棉前景好[J];农业知识;1998年12期
3 ;“转基因抗虫棉产业化”项目取得重大进展[J];农药市场信息;2002年20期
4 李德新;;我科学家研究转基因抗虫棉获大奖[J];农药市场信息;2003年11期
5 邹奎;我国转基因抗虫棉品种产业化探讨[J];种子科技;2004年03期
6 ;三个转基因抗虫棉新品种通过专家鉴定[J];科技致富向导;2008年03期
7 杨光;;我国转基因抗虫棉打破国外垄断[J];农药市场信息;2011年10期
8 段冰,呼孟银,傅振华;抗虫棉早衰原因及控制措施[J];江西棉花;2005年04期
9 李成云;;我国转基因抗虫棉的培育及其特性[J];中学生物学;2007年01期
10 曾潜;肖立一;李景龙;戴恺;谢崇湘;;高品质转基因抗虫棉——湘杂棉13[J];中国棉花;2007年08期
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1 张玉霞;李茂营;杜明伟;田晓莉;李召虎;段留生;;UV-B辐射对转基因抗虫棉生长发育的影响[A];中国棉花学会2011年年会论文汇编[C];2011年
2 周关印;;我国转基因抗虫棉种子产业化发展思路探讨[A];2003年全国作物遗传育种学术研讨会论文集[C];2003年
3 周世文;周国华;廖兵;李国宝;;转基因抗虫棉GK19田间棉铃虫发生特点及防治措施[A];华中昆虫研究(第一卷)[C];2002年
4 牛永章;张名昌;郭宝德;张原根;黄穗兰;冀丽霞;;优质转基因抗虫棉稳定系的培育[A];中国生物工程学会第三次全国会员代表大会暨学术讨论会论文摘要集[C];2001年
5 范希峰;周勇;田晓莉;段留生;何钟佩;李召虎;;DPC与DTA-6复配对转基因抗虫棉产量及纤维品质的影响[A];2007年全国植物生长物质研讨会论文摘要汇编[C];2007年
6 陈源;张祥;王永慧;陈德华;;转基因抗虫棉高产群体质量指标及栽培技术[A];中国棉花学会2008年年会论文汇编[C];2008年
7 刘贤进;余向阳;张存政;王冬兰;董健;束春娥;;API转基因抗虫棉对棉铃虫中肠蛋白酶的抑制作用[A];走向21世纪的中国昆虫学——中国昆虫学会2000年学术年会论文集[C];2000年
8 郑志明;黄磊;袁连卿;孙玉德;;转基因抗虫棉的特性及病虫草害综合防治技术[A];黄河三角洲棉花生产发展论坛论文集[C];2005年
9 任晓明;杜明伟;田晓莉;段留生;李召虎;徐东永;陈谨;;缩节胺与密度互作对转基因抗虫棉产量和品质的影响[A];中国棉花学会2011年年会论文汇编[C];2011年
10 孙长君;;抗虫棉发展过程及发展前景[A];中国棉花学会2006年年会暨第七次代表大会论文汇编[C];2006年
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1 记者 胡其峰;转基因抗虫棉使北方农作物免受虫害[N];光明日报;2009年
2 记者 李禾;我自主研发转基因抗虫棉增产超20%[N];科技日报;2010年
3 卢怀玉 郭刚;国产转基因抗虫棉的田间管理[N];河南科技报;2002年
4 本报记者 薛冬  通讯员 潘楠;我国何以开展转基因抗虫棉研究[N];光明日报;2002年
5 王水强 李站双;转基因抗虫棉——银棉8号[N];山东科技报;2009年
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8 记者蒋建科;国产转基因抗虫棉深受农民欢迎[N];人民日报;2003年
9 王淮林 实习生 陈姝;转基因抗虫棉由深圳走向世界[N];深圳商报;2004年
10 本报记者 林菲 李付广;转基因抗虫棉产业化初步形成[N];农民日报;2003年
中国博士学位论文全文数据库 前4条
1 李茂营;NaCl胁迫对转基因抗虫棉生长和抗虫性影响及化学调控修复[D];中国农业大学;2014年
2 李孝刚;转基因抗虫棉对土壤生态系统影响的研究[D];南京林业大学;2011年
3 孙国清;不同抗虫棉品种杀虫蛋白表达研究及影响抗虫性分析[D];新疆农业大学;2010年
4 孟志刚;Bt杀虫基因的结构改造与功能研究[D];中国农业科学院;2012年
中国硕士学位论文全文数据库 前10条
1 陈晨;中国六省转基因抗虫棉对棉花害虫的影响及社会经济效益研究[D];中央民族大学;2013年
2 史勇敢;转基因抗虫棉创杂棉21号选育及配套栽培技术研究[D];安徽农业大学;2013年
3 时鹏涛;转基因抗虫棉花不同发育期叶片蛋白质组的比较分析[D];中国计量学院;2013年
4 韩吉春;转基因抗虫棉花不同地域差异蛋白的筛选鉴定[D];中国计量学院;2012年
5 储成;转基因抗虫棉对土壤微生物多样性的影响[D];南京师范大学;2012年
6 王成鹏;转Bt和Bt+CpTI基因棉对土壤微生物群落影响的研究[D];南京林业大学;2012年
7 翟立超;去早果枝对转基因抗虫棉生长生理的调控效应[D];河北农业大学;2012年
8 李向平;转Bt棉对弹尾目昆虫的种群动态及生理生化的影响[D];河南科技学院;2013年
9 顾万荣;转基因抗虫棉生育特征及氮磷钾吸收分配特点的研究[D];扬州大学;2005年
10 侯娜;转基因抗虫棉外源DNA插入整合结构分析及其特异性检测方法的建立[D];中国农业科学院;2012年
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