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《中国农业大学》 2003年
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化学诱导启动子的克隆、定点突变及功能分析

聂秀玲  
【摘要】: 调控基因表达的化学诱导系统在基因功能鉴定及植物生物工程方面具有广泛的应用价值。植物受到病原菌侵染后,感染部位产生过敏性坏死反应,在其它部位产生系统获得性抗性并伴随抗性基因包括病程相关蛋白(Pathogen-Related protein)基因的表达。其中一个PR基因PR-1a,不仅受病原菌诱导,而且受一些化学剂如SA、BTH等化学剂的诱导,其诱导应答由其启动子控制,因此PR-1a启动子可以应用于植物化学诱导系统中。 根据PR-1a基因的报道序列,设计两对引物,以烟草基因组为模板,通过PCR扩增得到900bp(IPl)和603bp(IPs)两个目标片段,序列测定表明克隆的启动子与报道序列具有99%的同源性,转录起始位点、TATA box及保守序列TGAC与报道序列均完全相同。通过PCR方法对克隆的两个启动子进行定点突变,使转录起始位点上游-137bp处A突变为C,得到两个突变启动子(IPMl、IPMs)。将花药盒元件插入突变位点,得到两个修饰的化学诱导启动子(IPMal、IPMas))。为了检测得到的启动子驱动效率及诱导活性,将所得到的启动子、定点突变启动子和插入花药盒的启动子与GUS基因连接,构建了6个植物表达载体,同时分别构建包含IPl∶∶barnase、IPMl∶∶barnase、IPMal∶∶barnase嵌合基因的植物表达载体。将前6个表达载体导入烟草,得到大量经Southern杂交验证的转基因植株。 用SA和BTH处理转基因烟草植株诱导GUS基因的表达,结果表明: 1.全长900bp启动子能够应答SA和BTH的诱导,而603bp长的启动子无论突变与否对SA和BTH均无应答,证明SA和BTH的应答区域在克隆启动子的转录起始位点上游575~872bp之间。 2.在转录起始点上游137bp定点将A突变为C后,对化学启动子的化学诱导应答性没有明显的影响,但对诱导效应的向上运输存在一定程度的阻抑作用。 3.在克隆的化学诱导启动子中适当位点插入花药盒可以使诱导应答集中于花药,从而使天然的化学诱导性启动子变成人工花药特异性启动子。 4.化学诱导剂BTH的诱导效率高于SA,且在有效诱导浓度范围内对植株没有生理毒性或所产生的生理毒性难以从表象观察到。 5.BTH能系统诱导PR-1a野生型启动子驱动GUS基因在转基因植株的叶、花药、萼片及成熟花粉中表达,而SA的诱导作用则具有某种时空局限性。 6.BTH在叶片中系统诱导时间为施药后的15天,诱导作用可以持续25天以上,而且诱导效应沿主茎上下运输,而SA仅诱导处理部位的基因表达。 7.1.2mM以下浓度范围内,BTH的浓度越高,诱导基因(GUS)表达的强度越强,而在0.1~5.0mM浓度范围内,随着浓度的增加,SA在植株中的运输速度有加快的趋势,表现为诱导GUS表达的叶片增多。
【学位授予单位】:中国农业大学
【学位级别】:博士
【学位授予年份】:2003
【分类号】:Q785

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