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《中国农业大学》 2003年
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Ⅰ型马立克氏病病毒pp38和pp24基因的表达及序列测定与分析

姜世金  
【摘要】: 本研究将Ⅰ型MDV Md11株的pp24基因的完整ORF克隆入原核表达载体pGEX-6P-1中,重组质粒pGEX-pp24转化BL21宿主菌后,经IPTG诱导表达。诱导菌体裂解物经SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)后,用山羊抗GST抗体进行Western-blotting试验,结果确证了GST-pp24融合蛋白的表达。将表达产物从凝胶中回收,免疫4周龄小白鼠,五次免疫后,采血分离血清。所得血清分别与GA、Md11和CVI988株MDV感染的鸡胚成纤维细胞(CEF)进行间接免疫荧光试验(IFA),结果表明大肠杆菌表达的pp24基因至少保留了部分天然pp24蛋白的抗原性。 将Ⅰ型MDV Md11株的pp38基因和pp24基因的完整ORF分别克隆入真核表达载体pcDNA3.1/Zeo(+)中,重组质粒pcDNA3.1-pp38和pcDNA3.1-pp24在脂质体作用下分别转染CEF,在转染后24、48、72小时,用单抗H19和pGEX-pp24原核表达产物制备的抗血清分别对pcDNA3.1-pp38和pcDNA3.1-pp24转染的CEF进行IFA检测,结果检测到了pp38和pp24在CEF中的表达,该试验也使pp24基因在原核和真核系统中的表达得到了相互验证。 为研究pp38和pp24之间的关系,将Ⅰ型MDV Md11株的pp38基因和pp24基因的完整ORF克隆到真核双表达载体pBudCE4.1中,转染CEF后,通过IFA检测和用抗pp24多克隆血清进行Western-blotting试验检测到了pp38和pp24磷蛋白的共表达。 对包括Ⅰ型MDV疫苗毒、强毒、超强毒、特超强毒共7个国际参考株与7个中国分离野毒株的pp24基因和pp38基因分别进行了克隆测序,序列分析结果表明,Ⅰ型MDV的pp24基因和pp38基因均非常保守,比较的15个毒株的pp24基因的核苷酸和氨基酸之间的同源性分别高于98.9%和98.1%,同时比较的14个毒株的pp38基因的核苷酸和氨基酸之间的同源性分别高于99.4%和99.0%。除了pp38基因的第320位(A→G)和第326位(A→G)核苷酸发生变异,相应的第107位(Q→R)和第109位(E→G)氨基酸发生改变最终导致抗原位点发生变化外,两个基因中的其它核苷酸变异均未引起明显的抗原性改变。对pp24基因和pp38基因进行同源性比较分析的结果表明,绝大多数毒株二者的前195个核苷酸完全一致,不同毒株间的第81位核苷酸的差异(G/C)并不引起编码的氨基酸变化,仅仅与地域分布有关,这很可能是MDV在长期病毒衍化过程中形成的地域性遗传标志,而与病毒的分离年代及MDV的致病型等因素无关。 另外,本文还用pp38特异的PCR产物标记的核酸探针,对来自包括台湾在内的全国10个省37个鸡群共792只鸡的病理组织样品进行了检测,同时用REV SNV株全基因组cDNA克隆标记的探针检测REV,用CAV Cux-1株全基因组克隆标记的探针检测CAV。结果表明:发病鸡中这三种病毒的检出率均相当高,分别为84%(MDV)、62.8%(CAV)和58.8%(REV):病鸡中存在非常严重的双重感染(32.6%)和三重感染(45.7%);37个鸡群中的28个存在三重感染(75.6%),5个鸡群存在MDV和CAV的共感染(13.5%),3个鸡群存在MDV和REV的共感染(8.1%),仅有1个鸡群未检测到这三种病毒;在地域分布上,除了广西未检测到CAV外,其余的9个省份均检测到了MDV、CAV和REV,显示这三种病毒在我国已广泛存在。
【学位授予单位】:中国农业大学
【学位级别】:博士
【学位授予年份】:2003
【分类号】:S852.65

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【引证文献】
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中国博士学位论文全文数据库 前2条
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【参考文献】
中国期刊全文数据库 前10条
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【共引文献】
中国期刊全文数据库 前10条
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中国重要会议论文全文数据库 前10条
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10 王晓丽;邵卫星;单虎;;表达鸡传染性喉气管炎病毒GB基因重组鸡痘病毒转移载体的构建[A];首届中国兽药大会——兽医生物制品学、兽医微生物学学术论坛论文集(2008)[C];2008年
中国博士学位论文全文数据库 前10条
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中国硕士学位论文全文数据库 前10条
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中国博士学位论文全文数据库 前5条
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中国硕士学位论文全文数据库 前2条
1 丁家波;马立克氏病病毒囊膜糖蛋白gI基因的分子生物学特性[D];扬州大学;2001年
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【二级引证文献】
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中国硕士学位论文全文数据库 前8条
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中国博士学位论文全文数据库 前1条
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2 陈立志;牛源致病性坏死梭杆菌分离鉴定及其白细胞毒素免疫特性研究[D];吉林大学;2008年
3 赵宇军;猪戊型肝炎病毒结构蛋白基因表达及其基因特异性噬菌体展示肽库构建[D];中国农业科学院;2005年
4 韩俊友;牛蛙皮肤抗菌肽分离纯化、基因克隆表达及生物学特性的研究[D];吉林大学;2007年
5 李静;海洋酵母菌Metschnikowia reukaufii W6b酸性蛋白酶的生产、基因克隆和表达的研究[D];中国海洋大学;2008年
6 游向荣;龙眼成花转变与成花逆转的差异蛋白质组学研究[D];福建农林大学;2009年
7 许波;抗菌/抗内毒素多肽葛佬素的表达、纯化及其生物活性的初步研究[D];第四军医大学;2004年
8 孙照刚;传染性喉气管炎病毒糖蛋白G基因的克隆、表达、蛋白功能研究以及缺失该基因病毒的重组[D];中国农业大学;2005年
9 郑银英;苹果茎沟病毒和褪绿叶斑病毒分子变异研究[D];华中农业大学;2005年
10 姜秀云;牛分枝杆菌主要保护性抗原基因的克隆、表达及免疫研究[D];吉林农业大学;2005年
中国硕士学位论文全文数据库 前10条
1 陈雄艳;人IL-24基因的克隆、表达及活性鉴定[D];苏州大学;2004年
2 赵艳丽;水稻中DNA甲基转移酶的原核表达及功能初步鉴定[D];东北师范大学;2010年
3 丁彪;小鼠IFRG15基因在植入前胚胎及原核表达的研究[D];安徽农业大学;2010年
4 牟静;多头带绦虫四川株六钩蚴Tm45W基因的克隆与原核表达[D];四川农业大学;2010年
5 刘志强;抗Cyclin D1人源胞内单链抗体的原核表达与鉴定[D];吉林大学;2011年
6 王轶;甘蓝型油菜“蜀杂九号”防御素基因全长cDNA的克隆与原核表达[D];四川大学;2005年
7 张淑华;心肌型脂肪酸结合蛋白的原核表达与应用研究[D];吉林大学;2006年
8 王云珑;拟南芥Athspr突变体的耐热性分析及Athspr基因的原核表达[D];兰州大学;2010年
9 李会娟;家蚕转胶蛋白基因的原核表达及功能的初步研究[D];浙江理工大学;2010年
10 欧阳锦凤;人博卡病毒结构蛋白VP1u,非结构蛋白ORFx和NP1的原核表达与抗体制备[D];华中师范大学;2011年
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