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《中国农业大学》 2004年
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牛IFN-α/γ基因的克隆、表达及重组蛋白的应用研究

史喜菊  
【摘要】: 本研究通过PCR克隆了我国地方品种晋南黄牛、荷斯坦奶牛、福安水牛、富钟水牛、环湖型牦牛以及野牦牛的IFN-α基因,构建了原核表达质粒pQE30/BoIFN-α。测序结果表明,六个克隆片段全长均为498个核苷酸,编码166个氨基酸的成熟蛋白,与文献报道的BoIFN-α各亚型相比,只有荷斯坦奶牛IFN-α基因与BoIFN-αA亚型存在一个点变异,其余五个克隆均为BoIFN-α新亚型,建议命名为BoIFN-αD_2、BoIFN-αI、BoIFN-αJ、BoIFN-αK和BoIFN-αL。pQE30/BoIFN-α在大肠杆菌JM109中表达出了一条分子量20kD的特异蛋白带,表达蛋白以包涵体形式存在,表达量占菌体总蛋白的25%。粗制rBoIFN-α在CEF/VSV和MDBK/VSV细胞系上的抗病毒活性分别为×10~5 U/mg和×10~6 U/mg,在MDBK细胞上对IBRV攻击有一定的抵抗力。这一结果表明BoIFN-α基因序列的变化并没有引起蛋白生物学活性改变,可能只与品种进化和地理分布有关。 从经Con A刺激的荷斯坦奶牛外周血淋巴细胞中提取总RNA,通过RT-PCR克隆了BoFN-γcDNA全基因,与克隆载体T-Easy连接。测序结果表明,BoFN-γ cDNA全长501个核苷酸,编码166个氨基酸的前体蛋白,与GenBank中BoIFN-γ序列存在不同程度的点变异。亚克隆BoFN-γ成熟肽基因,分别构建原核表达菌株pET28a/BoIFN-γ/BL21(DE3)和毕赤酵母表达菌株pPICZα/BoIFN-γ/GS115。原核表达菌株在30℃和37℃均表达出18kD目的蛋白,37℃表达量占菌体总蛋白的37%,表达蛋白以包涵体形式存在;30℃表达量占菌体总蛋白的18%,但25%的表达蛋白以可溶形式存在于裂解上清中。BoFN-γ在酵母中实现了高效分泌表达,表达产物直接分泌到培养上清中,表达量高达1.0g/L。抗病毒活性试验表明,rBoIFN-γ(P.pastoris)在CEF/VSV和MDBK/VSV细胞系上的抗病毒活性分别达×10~5 U/mg和×10~6 U/mg,而rBoIFN-γ(E.coli)的抗病毒活性分别达×10~4 U/mg和×10~5 U/mg,统计学分析差异显著。 从PMD-18/VP1中亚克隆了FMDV抗原基因VP1,分别将VP1及VP1与BoIFN-γ在毕赤酵母中进行了表达与共表达。表达的VP1蛋白分子量为28kD,共表达蛋白BoIFN-γ/VP1分子量为52kD,表达产物直接分泌到培养上清中,表达量高达1.0g/L。 将毕赤酵母表达的rVP1、rBoIFN-γ和共表达rBoIFN-γ/VP1蛋白分别免疫小鼠,分别于每次免疫后2周采血、分离血清,ELISA测定血清抗体效价;末次免疫后2周分离脾脏淋巴细胞,用MTT法做T淋巴细胞增殖试验:通过半定量RT-PCR检测细胞因子IFN-γ、IL-2、IL-4和IL-10表达水平,试验结束前三天做迟发型超敏反应。小鼠免疫试验结果表明,毕赤酵母表达的VP1蛋白具有良好的免疫原性,可以刺激免疫小鼠产生明显的体液免疫和细胞免疫反应;rBoIFN-γ具有很强的免疫佐剂效应,与VP1蛋白联用或BoIFN-γ/VP1共表达蛋白能显著增强小鼠的体液免疫和细胞免疫水平,血清IgG抗体水平显著升高,T细胞增殖反应显著增强,抗原特异性迟发型超敏反应(DTH)更强烈,Th1型和Th2型细胞因子表达量同时增高,而且共表达蛋白免疫效果优于联合免疫,各项免疫指标更高。
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