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《中国农业大学》 2004年
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猪繁殖与呼吸综合征病毒N、GP5蛋白的表达、纯化及结构分析

黄金海  
【摘要】: 猪繁殖与呼吸综合征是由猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)引起的一种以母猪繁殖障碍和仔猪呼吸道疾病为特征的传染病。由PRRSV基因组ORF5、ORF7编码的GP5、N蛋白是其主要的结构蛋白。本研究通过构建PRRSV BJ-4株ORF5、ORF7不同的原核表达载体,应用不同的纯化方法,获得高纯度的重组表达蛋白,通过对纯化蛋白的圆二色谱(CD)分析,绘制出GP5、N蛋白的二级结构图,从结构生物学的角度分析了PRRSVN、GP5蛋白结构与功能的关系。 分别应用pGEX-6P-1、pET28a表达载体,获得核衣壳蛋白N的可溶性表达。将猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)PRRS BJ-4株N基因克隆至原核表达载体pGEX-6P-1,重组质粒pGEX-6P-N在E.coli BL21细胞中可溶性表达融和蛋白GST-N,经GST亲和层析获得重组蛋白GST-N,应用Prescission Protease切割获得纯化的N蛋白;将BJ-4株N基因克隆至原核表达载体pET28a,得到重组表达载体pET28-N,转化E.coli BL21(DE3)细胞,获得可溶性表达,表达量占菌体蛋白的28%。经Proband Ni~(2+)亲和层析获得重组蛋白P28-N。 通过生物信息学分析,应用pGEX-6P-1、pET32a表达载体,分别构建了缺失信号肽的GP5蛋白及缺失跨膜域的GP5突变体原核表达载体pGEX-6P-dE、pGEX-6P-dEM、pET32-dEM,表达量分别为16%,32%,50%。进一步通过包涵体变性复性、分子筛凝胶层析、GST亲和层析获得纯化的重组表达蛋白GST-dE、GST-dEM和P32-dEM。 应用圆二色谱测定纯化的P28-N、GST-dE、GST-dEM等蛋白,计算相应的二级结构组成,结合生物信息学分析,绘制出GP5、N蛋白的二级结构图。对P28-N重组蛋白的CD分析表明,P28-N中α螺旋、β折叠、T-转角、蜷曲分别为26.1%,23.7%,19.8%和30.3%;根据PDB中PRRSVVR2332株N蛋白C端部分三级结构,经同源模建绘制了BJ-4株相应域的三级结构;结合P28-N的结构预测,绘制出PRRSV N蛋白的二级结构图。N蛋白二级结构中,α螺旋由40个aa组成,形成2条β链(12aa),含有多处β转角(14aa)。圆二色谱对GST-dEM蛋白的分析表明,GST-dEM含有44%(155aa)的α螺旋,14.4%的β链(约50aa)。应用PDB中已解析的部分GST结构信息校正融合分子的结构;通过多种结构预测方法比较,确定共同保守域的二级结构;结合圆二色谱二级结构的检测结果,进一步绘制出PRRSV BJ-4 GP5蛋白的二级结构图。GP5蛋白α螺旋约58 aa,β链约56aa,β转角14aa,其它为无规则蜷曲。 根据N、GP5的二级结构,从结构的角度分析了PRRSV GP5、N蛋白结构与其功能的关系。N蛋白的二级结构与其参与病毒核衣壳的形成、NLS穿梭运转功能及其线性表位的形成等功能密切相关,N蛋白3个α螺旋区及β链对N蛋白衣壳的结构形成起重要作用。通过对GP5二级结构的分析,为PRRSV GP5的变异、免疫原性、GP5的诱变表位等功能的认识提供了依据。
【学位授予单位】:中国农业大学
【学位级别】:博士
【学位授予年份】:2004
【分类号】:S852.65

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