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《中国农业大学》 2004年
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异种克隆牦牛,羚牛及相关机理的研究

李彦欣  
【摘要】: 在保护濒危动物和进行核质互作分析方面,异种克隆技术是非常有效的方法。本研究利用牛卵母细胞作为受体,通过显微操作与牦牛或羚牛体细胞构建异种重构胚,将牦牛的异种重构胚移植到代孕牛中,获得了妊娠,并有望于2004年6—7月间出生。此外本研究还对异种克隆技术和异种体细胞核重编程进行了初步探讨。 1 供体细胞的培养:本实验从北京动物园、青海互助县、秦皇岛野生动物园分别采集了羚牛和牦牛组织样,建立了21个细胞系。细胞系种类包括耳成纤维细胞、输卵管上皮、颗粒细胞系三种。实验证明样品采用0℃保存48小时,对细胞系的建立无负面影响。这为野外收集珍稀动物组织,建立细胞系提供了切实可行的方法。 2 体细胞克隆技术基础平台的建立:首先,在去核方法上,本实验比较了H33342染色法,盲吸法和高渗法并结合这三种方法作了优化,形成本实验的去核方法:其次,本实验利用牛卵母细胞孤雌激活的方法,比较了四种激活方法,发现利用复合激活方法比单个化学试剂激活效率高(83.6、68.7:45、62.5),而在复合激活的方法中以A23187+6-DMAP激活效率较高(分裂率,83.6);最后,通过比较M199培养液和CR1aa培养液对孤雌激活胚胎的培养效率,发现CR1aa培养液较适合牛胚胎的培养。 3 异种克隆牦牛囊胚研究:本实验利用不同个体的牦牛耳成纤维细胞、颗粒细胞和输卵管细胞,分别作为供核细胞移入去核牛卵母细胞中,均可完成体外牦牛的早期囊胚发育(囊胚率高达35%)。通过对不同年龄阶段、不同个体、不同细胞类型、细胞的饥饿与否、细胞冷冻与否,以及卵母细胞成熟率,不同融合到激活时间对克隆效率的比较发现:卵母细胞的质量是克隆成功的基础,当成熟率在40%以下时,将显著影响异种克隆牦牛的囊胚发育(由25%降到3%,P<0.01);影响异种克隆牦牛早期囊胚发育的重要因素为延迟激活时间,当延迟激活1.5小时可显著提高异种克隆囊胚率(由21%提高到35%,P<0.05);而不同类型细胞、不同个体、不同年龄、饥饿与否、冷冻与否对异种克隆牦牛早期囊胚发育影响不显著,这为简化供体细胞的处理提供了依据。 4 通过将羚牛和牦牛的异种克隆发育情况、囊胚总细胞数和克隆牛进行比较发现:(1)异种克隆羚牛胚胎在体外可以发育到囊胚阶段,囊胚率为5%左右:(2)利用相同的克隆技术,同种克隆牛、异种克隆牦牛、异种克隆羚牛之间克隆效率差异显著(48%;28%;5%,P<0.01) (3)三种克隆囊胚的细胞数无差异。这些结果说明牛卵母细胞可以支持羚牛、牦牛、牛成纤维细胞核进行重编程,但是囊胚发育率种内较异种克隆高(牛高于牦牛、羚牛),物种间距离越近克隆效率越高(牦牛高于羚牛)。 5 由于异种克隆所用的卵母细胞不是同一物种,有必要对克隆后囊胚的核,线粒体遗传物质进行鉴定。本实验对异种克隆牦牛和羚牛囊胚鉴定结果表明:囊胚核基因组来自牦牛和羚牛供核 中国农业大学博士学位论文 中文摘要 细胞,说明本实验获得的囊胚是真正异种体细胞克隆的结果;囊胚线粒体以牛卵母细胞线粒体为 主,耗牛或羚牛供体细胞线粒体含量甚微。 6异种克隆耗牛胚胎进行移植:共移植耗牛胚胎185枚,用受体牛60头,其中有近33头的 受体牛返情期延长,移植后第60天直肠检查确认有3头怀孕。7个月后,1头牛妊娠仍然正常, 为通过异种克隆的方法保护珍稀动物提供了依据。 7目前在较近的物种之间进行异种体细胞克隆虽然已有成功的报道,但是多数报道的异种体 细胞克隆都发育到囊胚阶段,最多妊娠几个月。本实验在异种克隆耗牛实验中也发现了这一问题。 为了较全面的探索其基因方面的原因,则需要对大量的候选基因进行分析。而利用传统的RT一PCR 方法从单个卵母细胞或胚胎中获得的RNA量不足以分析大量的基因。本研究利用并优化了一套全 新的扩增细胞中整体cDNA的方法,使微量材料进行大量的基因表达分析成为现实。通过该方法, 本实验检测了6个重要基因在耗牛体细胞和牛卵母细胞和耗牛异种体细胞克隆胚胎的表达情况; 同时对耗牛异种体细胞克隆囊胚的内细胞团/总细胞的比例进行了检测。结果表明耗牛体细胞功 能基因波形蛋白基因和胶原蛋白基因只在耗牛细胞中检测到,说明耗牛体细胞的基因表达得到了 重编程。发现cx43和乃油乙夕这两个对细胞和胚胎重要的基因在耗牛细胞和胚胎中均表达;两个 对胚胎发育重要的基因人吸”hZ和116不在供体细胞中表达,在胚胎中有表达,但其起始表达的时 期异常。耗牛异种体细胞克隆囊胚的内细胞比例显著高于牛人工受精囊胚。由此可推测,滋养层 细胞比例过少和胚胎发育重要的基因表达起始时期异常可能与异种体细胞克隆胚胎妊娠困难和 流产率高有关。 8在此次研究中发现,作为干细胞标志的Ocl4基因在牛和耗牛体外培养的细胞系中也有大 量表达。利用原位杂交技术检测发现Ocl4在牛卵母细胞、牛克隆和IVF胚胎、异种克隆耗牛胚 胎、牛体外培养的细胞系和耗牛体外培养的细胞系中均有表达。说明Oct4基因在牛和耗牛中并 非只在干细胞中表达,推测该基因可能具有种属特异性。
【学位授予单位】:中国农业大学
【学位级别】:博士
【学位授予年份】:2004
【分类号】:S814.8

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【引证文献】
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【同被引文献】
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7 包鹏甲;阎萍;梁春年;郭宪;丁学智;;高寒牧区牦牛冷季暖棚饲养技术要点[A];《第六届中国牛业发展大会》论文集[C];2011年
8 ;国家肉牛牦牛产业技术体系简介[A];中国畜牧兽医学会养牛学分会2011年学术研讨会论文集[C];2011年
9 丁学智;郭宪;梁春年;阎萍;;甘南牧区牦牛产业发展与生态环境建设浅议[A];《第六届中国牛业发展大会》论文集[C];2011年
10 李彦欣;戴蕴平;杜卫华;赵春江;王莉莉;王海平;刘颖;李荣;李宁;;影响异种克隆牦牛囊胚发育的研究[A];中国畜牧兽医学会2004学术年会暨第五届全国畜牧兽医青年科技工作者学术研讨会论文集(上册)[C];2004年
中国重要报纸全文数据库 前10条
1 记者 王朝霞 实习生 刘婉琼;甘南牦牛纳入中国畜禽遗传资源目录[N];甘肃日报;2010年
2 莫建;“彼阳牦牛”补上一课[N];经济日报;2001年
3 记者 谢伟;全区牦牛育肥项目现场会在那曲召开[N];西藏日报;2008年
4 记者 巴桑次仁;类乌齐县组建牧民牦牛育肥协会[N];西藏日报;2008年
5 宋海云;我州首个牦牛扩繁基地在久治建成[N];果洛报;2010年
6 索穷;“高原迎宾第一人”[N];西藏日报;2003年
7 娜娜;雅江牦牛改良走出困境[N];中国畜牧兽医报;2008年
8 普穷;牦牛冬春季放牧注意事项[N];西藏日报;2002年
9 本报记者 王开波 李成业;“羚羊速度”与“牦牛精神”[N];西藏日报;2010年
10 记者 朱颖;我区成立牦牛研究与发展中心[N];西藏日报;2004年
中国博士学位论文全文数据库 前10条
1 李彦欣;异种克隆牦牛,羚牛及相关机理的研究[D];中国农业大学;2004年
2 雷安民;山羊-牛异种细胞核移植研究[D];西北农林科技大学;2004年
3 王召锋;牦牛驯化和适应:线粒体基因组证据[D];兰州大学;2011年
4 鱼小军;牦牛粪维系青藏高原高寒草地健康的作用机制[D];甘肃农业大学;2010年
5 后晓南;小鼠囊胚体外侵袭肿瘤细胞现象的初步解析[D];重庆医科大学;2002年
6 杨世华;几种生殖激素对体外培养的牦牛卵泡颗粒细胞凋亡的影响[D];甘肃农业大学;2002年
7 安登第;牦牛瘤胃微生物基因组文库构建与16S rDNA生物多样性研究[D];甘肃农业大学;2003年
8 张勇;双峰驼和牦牛繁殖季节褪黑素与促性腺激素之间的关系[D];甘肃农业大学;2000年
9 李大强;恶性肿瘤细胞与囊胚滋养层细胞侵袭性生物学行为的比较性研究[D];重庆医科大学;2003年
10 方贞付;人胚胎干细胞和兔胚胎干细胞的建系与鉴定[D];中国科学院研究生院(上海生命科学研究院);2005年
中国硕士学位论文全文数据库 前10条
1 王晶;人牛异种克隆与牛同种克隆的研究[D];内蒙古农业大学;2010年
2 王国生;牦牛能量物质转运及代谢的部分相关基因的克隆测序、表达谱及多态性研究[D];西南民族大学;2011年
3 张莹;牦牛适应高寒营养胁迫的尿素氮代谢机制[D];兰州大学;2010年
4 马苗苗;羊—牛异种克隆胚胎供核细胞线粒体命运的研究[D];西北农林科技大学;2012年
5 章志国;波尔山羊—兔异种克隆胚胎连续核移植及克隆胚移植研究[D];安徽农业大学;2003年
6 郝明超;牦牛乳腺上皮细胞系的建立与生物学特性研究[D];甘肃农业大学;2012年
7 季静娟;人-兔异种体细胞核移植构建克隆胚的实验研究[D];安徽医科大学;2004年
8 姚志诚;贺兰山野化牦牛食性研究[D];东北林业大学;2012年
9 孙凯;牦牛病毒性腹泻/粘膜病病毒全基因的测序、表达与生物信息学分析[D];西南民族大学;2012年
10 敬晓棋;山羊早期胚胎端粒酶活性测定及克隆胚胎超微结构观察[D];西北农林科技大学;2005年
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