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《中国农业大学》 2004年
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采用转染血液循环期原始生殖细胞方法和鸡—兔异种动物核移植方法制备转基因鸡

周振明  
【摘要】: 鸡的原始生殖细胞(Primordial germ cells, PGCs)是鸡各级生殖母细胞和成熟配子共同的祖先,最终发育分化成卵子或者精子。对鸡PGCs进行体外或者体内转染外源基因操作,再通过后代的筛选,就能获得转基因的后代。本论文首先对鸡PGCs的迁移路径进行确定,然后根据PGCs迁移的位置进行转染外源基因,最后通过后代筛选获得了转基因的后代。同时,采用异种动物核移植和嵌合体制备的方法以期获得转基因鸡。为此,本文主要进行了以下研究: 1,鸡PGCs迁移过程中的抗体检测:应用两种单克隆抗体MC-480和2C9对PGCs迁移的路径和规律进行确定。同时利用PGCs含有大量糖原颗粒能够进行PAS反应的特点确认细胞的类型,结果表明生殖新月组织中的PGCs,血液循环期的PGCs和性腺中的PGC都具有免疫组化阳性反应。根据实验的结果可以推论PGCs在迁移的过程中具有抗单克隆抗体MC-480抗原分子和抗2C9单克隆抗体抗原分子。 2,鸡胚发育早期的性别鉴定和血液循环期PGCs含量的差异:在胚胎发育早期(13-17期)应用M-PCR进行胚胎性别的早期鉴定。结果为:18S核糖体基因上256bp的片段在公鸡和母鸡的DNA样品中均有扩增,W染色体上高度重复序列EcoR Ⅰ家族的447bp片段只在母鸡的DNA样品中有扩增。研究表明:在胚胎发育的早期(13和14期),雌性胚胎血液中的PGCs含量显著高于雄性胚胎。随着胚胎的发育,雌性胚胎和雄性胚胎血液中的PGCs含量差异逐渐消失,17期血液中PGCs的含量没有差异。因此,13期转染血液循环期的PGCs有利于制备转基因的母鸡,14-15期转染内源性的PGCs有利于制备转基因的公鸡。 3,胚胎背主动脉注射对胚胎性腺中PGCs数量的影响:鸡胚发育至14-16期,经背主动脉胚胎微注射DMEM,对雌性胚胎性腺切片PAS染色进行PGCs计数,结果表明正常发育组4枚胚胎PGCs的平均数为64±2.97,机械损伤组5枚胚胎的平均数为51.6±4.23,两者之间差异显著(p<0.05)。说明背主动脉注射造成胚胎性腺中PGCs的数量下降,但是其对胚胎的活性没有影响。 4,质粒转染血液循环期PGCs制备转基因鸡:鸡胚胎发育至15期,脂质体-质粒DNA复合物进行背主动脉注射,转染血管中循环期的PGCs来制备转基因鸡。根据注射质粒类型的不同分成两组,注射质粒pEGFP-N1组和注射质粒pEOVALG组,两组PCR检测结果表明5日龄、10日龄胚胎和18日龄胚胎的基因组DNA中能够扩增出GFP基因上471bp的目的片段,注射质粒pEOVALG组性成熟的1只母鸡和2只公鸡的血液中检测到外源GFP基因的存在,后代PCR筛选未获得转基因的后代。注射质粒pEGFP-N1组4只成年的母鸡血液中检测到外源GFP基因的存在,G0代母鸡进行后代PCR筛选的结果表明4只鸡将外源基因传递给后代的效率从5%到53.6%。G1的血液样品经PCR扩增后471bp的目的片段中,测序结果表明目的片段与pEGFP-N1中GFP基因序列完全一致。利用质粒pEGFP-N1中绿色荧光蛋白基因上的471bp的片段作为探针,与G1代的基因组DNA,进行ECL法斑点杂交,27只G1斑点杂交的结果呈阳性,转基因种系传递的效率为19.6%(27/138)。G1胚胎孵化36h,将胚胎整体取下,荧光显微镜下蓝光激发,观察到胚胎整体呈绿色。G1胚胎孵育5d,荧光显微镜观察结果表明肾脏呈绿色。因此,转染血液循环期PGCs可以高效获得转基因鸡。 5,鸡—兔异种动物核移植获得重构囊胚:将鸡的胚盘细胞注入到兔MⅡ期去核的卵母细胞中, 重新构建的鸡一兔异种动物克隆胚胎能够发育到囊胚阶段。当X期鸡的胚盘细胞注射到卵时, 83.51%的重构胚体能够融合,6.27%的融合胚胎能够进一步发育,形成与哺乳动物相似的囊胚 腔。PCR鉴定和核型分析的结果表明桑堪胚和囊胚的遗传物质来源于供体鸡细胞。应用线粒体特 异性引物扩增的结果表明重构胚体中同时具有供体鸡和受体兔的线粒体;单克隆抗体讹一480检 测和单克隆抗体2C9检测呈阳性;本研究结果表明兔的卵母细胞胞质能够将鸡胚盘细胞去分化和 进行重新编程,支持重构胚胎的早期发育。
【学位授予单位】:中国农业大学
【学位级别】:博士
【学位授予年份】:2004
【分类号】:S852.5

【引证文献】
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【参考文献】
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【共引文献】
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【同被引文献】
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【二级参考文献】
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【相似文献】
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