抗牛精子膜蛋白单链抗体基因的克隆与表达

【摘要】： 由于精子膜蛋白结构上的多形性、功能上的复杂性，加之缺乏有效的分离纯化手段，有关精子膜蛋白的研究一直是一个难点。sp18是由本实验室首次发现的一组牛精子膜蛋白，由于尚未纯化得到sp18，有关sp18的研究难以突破。为此，本研究从分泌抗sp18单抗的杂交瘤细胞入手，欲克隆其抗体基因并分析其序列特征，以此推测其针对的抗原性质。 应用重组噬菌体抗体库技术，从分泌小鼠抗牛精子sp18抗体的杂交瘤细胞系中分离总RNA，克隆抗体重链和轻链可变区基因，加入连接肽引物(Linker primer)组装成单链抗体ScFv(single chain fragment variable)基因并用RS引物进行扩增，Sfi Ⅰ、Not Ⅰ酶切，回收后与pCANTAB5E载体相连，转化E.coli TG1宿主菌，构建单链抗体文库。经辅助噬菌体M13K07超感染，将ScFv展示于噬菌体表面。以牛精子作为包被抗原，经过三轮“亲和吸附-洗脱-扩增”的淘选后，进行phage-ELISA筛选和鉴定，在波长450nm处测定吸光值，吸光值在阴性对照两倍以上的视为阳性克隆。取阳性重组噬菌体抗体克隆株pCSA1，PCR扩增其ScFv基因，筛选重组子进行序列测定，发现其序列符合小鼠抗体基因的一般特征，并且与几株抗磷酸胆碱的抗体重链和轻链可变区序列的同源性达80％以上；推测pCSA1 ScFv针对的抗原是磷酸胆碱类物质。将pCSA1 ScFv基因克隆到pET-30a(+)载体上，用IPTG进行诱导表达，SDS-PAGE蛋白电泳分析，发现重组蛋白表达量占菌体总蛋白含量的30％。这些结果表明，本研究成功获得了杂交瘤细胞的单链抗体基因，并且在大肠杆菌细胞中得到了高表达；推测抗sp18单抗针对的抗原可能是磷酸胆碱类物质。 精子蛋白种类繁多，为了进一步研究牛精子蛋白功能，本研究欲构建一个针对牛精子的噬菌体抗体文库。首先用牛精子免疫雌性四周龄BALB／c小鼠，从其脾脏组织分离总RNA，应用重组噬菌体抗体库技术，构建了一个针对牛精子的噬菌体抗体文库。经PCR检测，计算文库的有效库容为1.2×10~4TFU。用phage-ELISA从文库中筛选并鉴定出一个针对牛精子的阳性克隆，序列分析发现，该单链抗体克隆的序列符合小鼠抗体可变区的一般特征，这说明构建的针对牛精子的噬菌体抗体文库是成功的。 本研究成功获得了杂交瘤细胞的单链抗体基因，并且推测抗sp18单抗针对的抗原可能是磷酸胆碱类物质；成功构建了针对牛精子的噬菌体抗体文库，为日后牛精子蛋白的功能研究与应用研究奠定了一定的基础。