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阿维链霉菌中聚酮合酶基因的遗传改造

张晓琳  
【摘要】: 阿维链霉菌(Streptomyces avermitilis)产生的阿维菌素(avermectins)是一组高效、低毒、广谱的杀虫抗生素,在医药、农业和畜牧业生产中具有良好的应用价值和广阔的市场前景。 阿维链霉菌发酵产生阿维菌素的同时,还产生另外一种聚酮化合物—寡霉素(oligomycin),寡霉素对哺乳动物有很高的毒性。本研究以产阿维菌素B和寡霉素的阿维链霉菌CZ8-73为出发菌株,构建了基因缺失载体pXL05,并将其转入CZ8-73中,通过缺失载体和染色体之间的同源双交换,对染色体上长达90kb的寡霉素聚酮合酶(PKS)基因簇(olmA)进行了缺失。将4株经Southern杂交验证正确的基因缺失突变株进行摇瓶发酵和HPLC检测,发现4个突变株均不再产生寡霉素而仅产阿维菌素B组分,阿维菌素的总产量和B1的产量与出发菌株相当,说明寡霉素PKS基因簇的缺失并不影响阿维菌素的生物合成。该缺失突变是在染色体上通过同源双交换完成的,不会发生进一步的重组,因此突变株性状稳定,在工业生产上具有应用价值。 阿维菌素的天然发酵产物共有八个组分,其中只有B1组分的杀虫活性最高,被作为杀虫剂在农业和畜牧业中使用。生产上需采用有机溶剂萃取和直接结晶法以获得阿维菌素B1。目前国内外尚未见有关仅产阿维菌素B1菌株的报道。根据阿维菌素PKS基因结构与其聚酮合成反应步骤之间的线性关系,推测B2组分的产生可能是由于阿维菌素PKS模块2中脱水酶(DH)的不完全活性所造成。我们以不产寡霉素而仅产阿维菌素B的工程菌Olm73-12为出发菌株,用委内瑞拉链霉菌(Streptomyces venezuelae)中编码pikromycin PKS模块2上完全活性的DH和酮基还原酶(KR)的DNA区域对Olm73-12染色体上编码阿维菌素PKS模块2中DH和KR的区域进行取代,试图构建仅产B1组分的基因工程菌。将构建好的基因取代载体pXL201(pKC1139∷5'flank+pikDH2-KR2+3'flank)转入出发菌株,共筛选得到160个Apr~s的双交换突变株。摇瓶发酵和HPLC分析结果表明,有99个突变株仍然产阿维菌素B的4个组分,其中82株的发酵单位很低,仅为出发菌株Olm73-12的0.1%~2%,从中挑取2株经PCR扩增和测序验证,均发生了正确的基因取代;没有检测到仅产B1的突变株,这表明阿维菌素B2组分的产生并不是因为阿维菌素PKS上DH2的部分活性所造成。 阿维菌素B1在C-22,23位的化学加氢还原产物称为伊维菌素(ivermectins),具有与阿维菌素相同的杀虫活性,但毒性更低,更安全。目前国内外报道的伊维菌素生产均是用化学还原法,生产成本很高。本研究利用基因取代载体pXL211(pKC1139∷5'flank+pikDH4-ER4-KR4+3'flank),将阿维链霉菌Olm73-12中阿维菌素PKS模块2上的DH和KR结构域用来自于pikromycin PKS模块4中一套完整的β-酮基还原酶域DH、烯基还原酶(ER)和KR所置换。在筛选的281个双交换突变株中,有27株除了产生阿维菌素B1a和B2a,还产生一个新组分,经HPLC和LC/MS分析,证实该组分为C-22,23双氢阿维菌素B1a(即伊维菌素B1a)。突变株伊维菌素B1a的产量很低,大约为1~4μg/mL,阿维菌素B1a和B2a的产量同样也很低,仅为出发菌株的0.5~2%。在281个突变株中,还筛选到了2个突变株,其发酵产物几乎全部为有效组分阿维菌素B1,B2组分仅占5%。 用Sa“3AI部分酶切阿维链霉菌野生型菌株ATCC31267的总DNA,回收23~30kb的片段, 以大肠杆菌链霉菌穿梭柯斯质粒pKC505为载体,连接后进行体外包装,并侵染E.。口11 DH5a, 构建了阿维链霉菌的cosmid基因组文库,为阿维菌素生物合成相关基因的克隆,以及阿维菌素 组合生物合成的研究奠定了基础。


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