美洲商陆抗病毒蛋白Ⅰ和Ⅱ基因功能的研究及叶片中抗病毒蛋白的分离

【摘要】： 美洲商陆抗病毒蛋白(PAPs)是一类能很好的抑制植物病毒的蛋白，很早就有报道低剂量的商陆叶片粗粉末就能明显的抑制TMV在菜豆叶片上局部枯斑的形成，PAP缓释剂也已用于病毒病的防治工作，但美洲商陆抗病毒蛋白属于核糖体失活蛋白，它对生长的细胞会有一定的毒性。本实验通过将PAP基因进行N-端信号肽的缺失和N-,C-两端都缺失，并在大肠杆菌中进行了表达，而且获得了两个有活性的表达蛋白，体外生物测定表明表达蛋白具有抑制TMV的活性，而对植物本身没有毒性，转PAP缺失型基因的烟草也表现出对TMV的抑制作用，它可以使烟草发病延迟20-25天，而且转缺失基因的烟草生长状况良好。 由于美洲商陆抗病毒蛋白Ⅱ(PAPⅡ)是一个受季节调控表达的蛋白，本实验以美洲商陆夏季叶片为材料，通过对其总RNA的提取、反转录、并用PAPⅡ的特异引物进行PCR扩增，对PAPⅡ进行了基因克隆、序列分析，结果扩增出来的PAPⅡ基因与已经报道的序列同源性是99.9％，然后将该基因构建到原核、真核表达载体上，分别转化了大肠杆菌和毕赤酵母并对它们进行了诱导表达，在两个表达系统中均获得了有活性的PAPⅡ表达蛋白，体外生物测定表明表达的蛋白均具有抑制病毒的活性，PAPⅡ基因在酵母中还没有表达的报道，这为获得具活性PAPⅡ蛋白提供了一种简便可行的方法。 据报道美洲商陆抗病毒蛋白是在美洲商陆不同组织和不同生长时期合成的—类蛋白，在叶片中已经纯化出三种抗病毒蛋白，它们是PAPⅠ，PAPⅡ，PAPⅢ。对美洲商陆春季、夏季、秋季采集的叶片，用50-80％饱和度硫酸铵沉淀出来的蛋白样品，经过SP阳离子柱后，上MQ阴离子柱，然后把活性蛋白峰再上MS阳离子柱或MQ阴离子柱分离，从春季叶片中分离出四个不同的抗病毒蛋白峰；从夏季叶片中分离出二个不同的抗病毒蛋白峰，这两个蛋白峰与春季叶片中分离出的活性蛋白峰都能重叠上；但从秋季叶片中只分离出来一个抗病毒蛋白峰，它和春季、夏季叶片中分离出的活性蛋白峰都重叠不上。可以认为在美洲商陆的叶片中可能还有新的抗病毒蛋白，并且多于目前已经报道的三个，但这需要大量分离、提纯蛋白进行下步研究。 以美洲商陆根为材料，提取其总RNA、反转录，用一对PAP基因的特异性引物和一对PAPⅡ的特异性引物，分别对反转录产物进行PCR扩增，将扩增的目的片段进行序列分析，结果扩增出来的PAP基因与已经报道的序列完全相同，扩增出来的PAPⅡ基因与已经报道的序列同源性也在99.8％，而且它们都各自编码一个开放阅读框架，可以说美洲商陆根中肯定存在PAP和PAPⅡ基因，并已经转录。