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CAV VP1、VP2融合基因在大肠杆菌中的克隆及表达

刘宝山  
【摘要】: 鸡贫血病毒是鸡传染性贫血的病原,对雏鸡能造成骨髓造血组织及胸腺等淋巴组织萎缩,引起贫血;对成年鸡能造成严重的暂时性免疫抑制。在CAV编码的三种蛋白中,VP1是结构蛋白,也是游离CAV粒子中存在的唯一蛋白组分;VP2是VP1的伴侣蛋白或骨架蛋白,辅助VP1组装成病毒衣壳。 据报道用共表达CAV VP1和VP2的杆状病毒裂解物免疫鸡可使其产生CAV中和抗体,但其表达量很低,不能适应生产中大规模使用的需要。如果大肠杆菌中表达的VP1和VP2融合蛋白也能形成中和抗原表位,则解决了这个问题。是否真能如此呢?本研究就是对其作一些前期研究,进行了VP1和VP2融合基因的克隆和表达。 本研究利用PCR扩增了CAV的VP1和VP2基因并进行了克隆测序,同时利用分子生物学软件对这两个基因进行了分析。然后将VP1基因分段克隆至原核表达载体pGEX-4T-1,经酶切及PCR鉴定,证明成功构建了重组表达载体pGEX-A、pGEX-B、pGEX-C。然后将VP2基因插入VP1重组表达载体,构建成功VP1和VP2的重组融合表达载体pGEX-D、pGEX-E、pGEX-F。 在1mmol/L的IPTG诱导下,融合蛋白在大肠杆菌BL21中以包涵体的形式得到大量表达。融合蛋白D、E、F的分子量分别为95kD、80kD、66kD。在Western-blot免疫印迹分析中,3个融合蛋白与CAV阳性血清均能发生特异性反应,表明它们都具有良好的反应性。多次洗涤包涵体后,用含1%SDS的溶解液溶解包涵体。然后用电洗脱方法对融合蛋白进行了纯化,获得了理想的纯化结果。 重组蛋白在低浓度下梯度透析复性后,用ELISA方法检测纯化的3个融合蛋白的反应性,结果只有F重组融合蛋白能同CAV阳性血清发生特异性结合,显示了很好的结果,可以用于检测试剂盒的调试或其免疫原性的后继试验。


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