Rhodococcus equi 4-2胆固醇氧化酶的发酵、纯化及初步应用

【摘要】： 胆固醇氧化酶(EC1．1．3．6)在食品加工、医疗检测、生物抗虫等方面的作用日益受到人们的重视，并且显示出巨大的应用潜力。胆固醇氧化酶可以用来降解食品原料中的胆固醇，生产低胆固醇的健康食品；在医疗检测中用作血清胆固醇含量的检测试剂；生物抗虫方面作为Bt．毒蛋白最主要的补充，对鞘翅目昆虫有强烈的毒杀作用。为此本课题从以下四个方面对马红球菌4-2(Rhodococcus equi 4-2)发酵产生的胞内胆固醇氧化酶进行初步的研究，以期对实践应用提供理论依据：胆固醇氧化酶的发酵产酶规律及发酵条件优化；胞内酶提取条件研究、部分纯化以及粗酶的基本特性分析；胆固醇氧化酶在食品加工及生物抗虫方面的应用；急性毒理学试验等。 Rhodococcus equi 4-2菌株的生长及产酶规律以72h为一个周期。氮源单因素试验证明，胰蛋白胨是产胆固醇氧化酶的最佳氮源。正交实验结果得到最佳配方为胆固醇2g／L，Tween 801ml／L，甘油不添加。二元二次正交回归组合试验得到的最佳参数为胆固醇2.192g／L，Tween 804.868 ml／L，酶活力预测值为610 U／L。验证试验结果证明酶活力最大值可达到621 U／L，增长率为141％。 10mmol／L磷酸钾缓冲液(pH7.5)+0.5％Triton X-100的提取液对胞内胆固醇氧化酶的提取效果最佳，提取时间为10min。不含有Triton X-100的极性溶液的提取效果较差，0.9％NaCl和pH7.5磷酸钾缓冲液相对而言具有稍好的提取效果。酶活力测定体系中含有1％Triton X-100时显色最深，红色均匀且稳定持久，酶活力最高。 酶蛋白中存在有含量相当高的糖组分，糖含量为3.763mg／ml，蛋白含量为1.106mg／ml，二者之比为3.4：1。酶促反应的最适pH7.5，酶活力稳定范围pH5.0～10.0。粗酶的热稳定性良好，40℃及40℃以下酶活力保持不变。 Rhodococcus equi 4-2菌体细胞对鸡蛋黄中胆固醇的降解率为49.26％，胞内酶提取液为40.92％，上清液为37.05％。杀虫试验表明饲喂15天时棉铃虫的死亡率分别是：胞内酶试验组100％，菌悬液组66.7％，上清液组40.0％。 胞内酶提取液的经口半数致死量LD_(50)大于21500mg／Kg，属于无毒级别。活菌制剂在细胞数在1.72×10~9个／ml剂量以下不会引起急性毒性反应。