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α-半乳糖苷酶固态发酵中试技术参数研究

王春林  
【摘要】:通过物理和化学复合诱变处理扬奇青霉(Penicillium janczewskii),筛选高产α-半乳糖苷酶(GAL)变异株,从培养的环境因素和培养基组分两方面优化了固态发酵(SSF)产酶条件,并进行中试生产,探讨了α-半乳糖苷酶粗制剂的性质及其在肉鸡日粮中的应用。首先建立了测定饲用青霉GAL活力的对硝基酚比色法,建议反应液pH为5.5,温度为40℃,时间10 min,比色波长405 nm。对出发菌株进行紫外线、甲基磺酸乙酯、亚硝基胍多次重复连续的诱变处理,获得产GAL活力较高的5个菌株。对菌株连续传代试验以及循环交替培养,筛选获得稳定产GAL的青霉菌株(Penicillium sp.)MAFIC-6,其基础产酶活力为147 U/g。青霉MAFIC-6合成α-半乳糖苷酶在一定程度上仍受葡萄糖阻遏,也受蔗糖、蜜二糖和棉籽糖部分诱导,说明该菌属于半组成型突变株。三角瓶和托盘SSF试验研究了影响产酶的各种环境因素。结果表明,培养基的初始适宜pH在5.5~6.5,发酵温度为26~32℃,水分宜控制在55%左右,在250 mL三角瓶中装曲量为50.7 g,培养75 h时,产α-半乳糖苷酶活力最高。托盘发酵研究了料曲温度和含水量变化规律,发现随着发酵进程,料曲内部温度可持续升高,水分则减少。对SSF培养基组分优化结果表明,苹果渣、甜菜渣、甘蔗渣部分替代麸皮时能显著提高酶产量,酵母粉和大豆粕是较好的氮源。在培养基中添加0.1%的Tween-80、Triton-100和EDTA均能显著地提高α-半乳糖苷酶产量。按四因素三水平正交设计安排试验。结果显示,豆粕、甜菜渣、硫酸铵和磷酸氢二钾各因素/水平依次为16%、4%、2%和2%时,酶活力达到172 U/g以上。保持硫酸铵含量不变,选择豆粕、甜菜渣和磷酸氢二钾的三因素/水平进行响应面分析试验。结果表明,当培养基中含豆粕19.20%、甜菜渣3.89%和磷酸氢二钾2.92%时,得到最高理论酶活力为174.98 U/g,与实验结果相符。分别在自然状态和调控状态下开展托盘SSF中间规模试验。结果表明,在自然SSF条件下,酵曲温度和含水量变化幅度较大,酵曲温度最高达到43℃,最后料曲水分损失22%,收获GAL活力为128.5 U/g;在调控状态下,通过调节曲房空气的温度和相对湿度,可以维持相对稳定的温度和含水量,酵曲高峰期温度仅维持在33.5~36.5℃,酵曲水分含量下降幅度较小。最后收获GAL活力达到166.3 U/g,比自然发酵酶活提高了29.4%。通风换气和喷无菌水是调节发酵过程中温度和水分的有效措施。GAL粗酶制剂稳定pH范围在3.5~6.5,最适温度50~60℃,在70℃以下时稳定,经过猪胃肠液仍能保持活力70%以上,金属离子影响酶活力。GAL对底物(对硝基苯酚-α-D-吡喃半乳糖苷)Km为1.38 mmol L~(-1),V_m为2.58 mmol L~(-1)s~(-1)。粗酶制剂中含有其它多种非淀粉多糖酶,在常温能稳定储存。在玉米-豆粕型日粮中添加GAL对肉鸡营养物质利用、生产性能、血清学参数利器官重量的影响进行了研究。结果表明,GAL能改善日粮代谢能水平和营养物质消化率,显著提高肉仔鸡早期生长阶段的生产性能,日粮能量与GAL添加水平间存在一定的互作效应。


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