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《中国农业大学》 2005年
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小麦苗期热胁迫基因表达谱分析及相关基因的克隆

彭丹辉  
【摘要】：小麦是我国重要的粮食作物。但随着温室效应的加剧,全球平均气温的不断升高,高温已经成为危害我国小麦生产的重要因素,每年造成巨大的经济损失。因此,开展小麦的耐热性研究对我国的农业生产具有重要的理论和现实意义。本研究的目的是通过对小麦苗期热胁迫前后基因表达谱的分析来揭示小麦热胁迫响应的分子机理,并分离相关基因,为通过基因工程手段提高小麦耐热性奠定基础。 以38℃热胁迫的小麦幼苗为处理组(HS),同期未经处理的小麦幼苗为对照组(CK),分别与Affymetrix Barley1基因芯片杂交。杂交结果显示在总共22840个探针中,对照组(CK)和热胁迫组(HS)共检测到8486个探针,占总探针数的37.2%。采用半定量RT-PCR和RealTimeRT-PCR的方法对12个基因进行验证,其中11个与芯片的结果一致,表明杂交结果真实可信。 对杂交结果的分析表明,共有892个探针发生了差异表达,其中469个表现为热胁迫后上调,423个表现为热胁迫后下调。差异表达的基因涉及到逆境胁迫、信号转导、物质运输、光合作用、蛋白代谢、脂肪代谢、碳水化合物代谢等多个方面。其中有大量热激蛋白和分子伴侣基因上调表达。上调表达的热激蛋白涉及到热激蛋白各个家族,且上调表达的平均倍数明显高于其它家族基因的上调倍数。另外泛素-蛋白酶体通路中的多个关键酶的基因也发生了差异表达,预示着负责蛋白质选择性降解的泛素-蛋白酶体通路也参与到了植物对热胁迫的应答机制。 选取芯片中的两个热胁迫后上调表达的基因,利用电子克隆方法,获得了它们具有完整ORF的序列,分别命名为TaCDPK和TaPK,TaCDPK推测的氨基酸序列具有钙依赖蛋白激酶(CDPK)典型的EF手性结构和丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶催化域,N端有一段豆蔻酰化位点;TaPK推测的蛋白具有典型的丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶催化域,N末端具有两段核定位信号。
【关键词】：小麦 热胁迫 基因表达谱 克隆
【学位授予单位】：中国农业大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2005
【分类号】：S512.1
【目录】：
  • 摘要3-4
  • ABSTRACT4-5
  • 目录5-7
  • 第一章 文献综述7-15
  • 1.1 植物耐热性研究进展7-14
  • 1.1.1 植物耐热的遗传学进展7-8
  • 1.1.1.1 耐热性的遗传学分析和细胞学定位7
  • 1.1.1.2 耐热性的QTL分析7
  • 1.1.1.3 耐热性相关的突变体和转基因进展7-8
  • 1.1.2 植物对高温胁迫应答的分子机制8-14
  • 1.1.2.1 植物对高温胁迫的适应-耐热性的获得8-9
  • 1.1.2.2 热激蛋白与植物耐热9-12
  • 1.1.2.3 植物激素与耐热12
  • 1.1.2.4 抗氧化与植物耐热12
  • 1.1.2.5 质膜与植物耐热12-13
  • 1.1.2.6 钙信号与植物耐热13-14
  • 1.2 本研究的目的和意义14-15
  • 第二章 利用AFFYMETRIX BARLEY1基因芯片对小麦热胁迫前后基因表达谱的分析15-25
  • 2.1 材料与方法15-16
  • 2.1.1 供试材料15
  • 2.1.2 总RNA的提取15
  • 2.1.3 RNA的反转录和生物素标记的cRNA的合成15-16
  • 2.1.4 芯片的杂交、洗涤、染色与扫描16
  • 2.1.5 数据分析16
  • 2.2 结果与分析16-22
  • 2.2.1 芯片质量以及杂交结果的可靠性分析16-17
  • 2.2.2 杂交结果分析17-19
  • 2.2.3 差异表达基因的功能分类19-22
  • 2.2.3.1 热激蛋白与分子伴侣相关基因热胁迫前后的表达变化20-21
  • 2.2.3.2 其它逆境相关蛋白基因热胁迫前后的表达变化21
  • 2.2.3.3 物质运输相关基因热胁迫前后的表达变化21
  • 2.2.3.4 泛素-蛋白酶体通路相关基因热胁迫前后的表达变化21-22
  • 2.3 讨论22-25
  • 2.3.1 利用大麦芯片进行小麦热胁迫前后基因表达谱分析的可行性22
  • 2.3.2 小麦热胁迫前后的基因表达谱分析22-25
  • 第三章 利用半定量RT-PCR和REALTIME RT-PCR的方法对芯片杂交结果的验证25-32
  • 3.1 材料与方法25-28
  • 3.1.1 供试材料25
  • 3.1.2 总RNA提取和纯化25-26
  • 3.1.3 cDNA合成26
  • 3.1.4 PCR引物设计及反应体系26-27
  • 3.1.5 扩增片段的回收其与pGEM-Teasy(promega)载体的连接27
  • 3.1.6 大肠杆菌感受态细胞的制备27
  • 3.1.7 连接产物转化27-28
  • 3.1.8 核酸序列测定、同源性比较28
  • 3.2 结果与分析28-31
  • 3.2.1 半定量RT-PCR验证结果28-29
  • 3.2.2 RealTime RT-PCR验证结果29-31
  • 3.3 结论31-32
  • 第四章 热胁迫响应基因TACDPK和TAPK基因的克隆32-46
  • 4.1 材料和方法32
  • 4.1.1 供试材料32
  • 4.1.2 电子克隆ORF的方法32
  • 4.1.3 模板准备、PCR扩增以及克隆、测序32
  • 4.2 结果与分析32-44
  • 4.2.1 TaPK基因的ORF拼接、克隆、测序以及序列分析33-37
  • 4.2.1.1 TaPK基因ORF的获得33-35
  • 4.2.1.2 TaPK基因推测蛋白的蛋白质性质分析35-36
  • 4.2.1.3 小麦TaPK基因编码蛋白质与其它物种同源基因氨基酸序列比较36-37
  • 4.2.2 TaCDPK基因的ORF拼接、克隆、测序以及序列分析37-44
  • 4.2.2.1 TaCDPK基因ORF的获得37-40
  • 4.2.2.2 TaCDPK基因推测蛋白的蛋白质性质分析40-42
  • 4.2.2.3 小麦TaCDPK基因编码蛋白质与其它物种同源基因氨基酸序列比较42-44
  • 4.3 讨论44-46
  • 4.3.1 TaCDPK基因的结构和功能分析44
  • 4.3.2 TaPK基因的结构和功能推测44-46
  • 结论46-47
  • 参考文献47-53
  • 致谢53-54
  • 作者简历54

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