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《中国农业大学》 2005年
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抗菌肽ABPS1提取纯化的初步研究及其与干扰素IFNa-2b融合表达载体的构建

张丽  
【摘要】:抗菌肽(antibacterial peptide, ABP)是一种具有广谱抗菌活性的小肽类物质。研究表明,除了抗菌活性外,抗菌肽还具有抗病毒、抗真菌和抗肿瘤作用。干扰素(interferon, IFN)是一类具有广谱抗病毒活性的糖蛋白,而且还有抑制肿瘤增殖、抗纤维化以及免疫调节等功能。 在已有高效表达融合蛋白ABPS1-GFP的基因工程菌的基础上,对融合蛋白的纯化条件进行了初步研究。首先将高效表达抗菌肽ABPS1的工程菌扩大培养,诱导表达后所得的菌体离心后进行冰浴下超声裂解,继而用表面活性剂TritonX-100和低浓度的尿素对包涵体进行充分洗涤,接着用高浓度的尿素裂解包涵体,然后在变性条件下对融合蛋白进行Ni-NTA亲和层析纯化,最后采用尿素梯度透析法对变性蛋白进行复性,并对包涵体变性、复性等条件进行了初步优化。 然而,将融合蛋白ABPS1-GFP裂解获得抗菌肽ABPS1的蛋白单体,必须使用化学裂解剂CNBr。CNBr是一种剧毒化学物质,很难购买;而且在基因工程产品的生产中,禁止使用CNBr。为此,我们对此表达载体进行了改造,构建了含有1个IFNa-2b基因和2个ABPS1基因的融合表达载体。首先在基因水平上,通过PCR的方法在各单体分子之间引入凝血因子Xa切割位点的识别序列,以质粒pET-28b(+)为载体,利用同裂酶BamHI与BglⅡ可以切出相同粘性末端的特性,通过酶切、连接、转化等操作,构建干扰素和抗菌肽的融合表达载体。经PCR、双酶切和DNA测序分析表明,串联体的DNA序列及阅读框完全正确。将干扰素IFNα-2b基因和抗菌肽ABPS1基因融合在一起,在大肠杆菌中进行表达,通过纯化后裂解可以同时获得这两种蛋白,为将ABPS1和IFNα-2b单独或联合应用于临床和生产实践奠定基础。
【学位授予单位】:中国农业大学
【学位级别】:硕士
【学位授予年份】:2005
【分类号】:TQ464.7

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