收藏本站
《中国农业大学》 2005年
收藏 | 手机打开
二维码
手机客户端打开本文

重组HLA-G1基因的克隆、原核表达、纯化及功能的初步研究

张海泉  
【摘要】:HLA-G是一种非经典的HLA-Ⅰ类分子,与人类免疫耐受有关。诱导对移植抗原的免疫耐受是使移植物获得长期存活的关键。人类和哺乳动物的妊娠过程是自然界中存在的一种天然的同种半异体免疫耐受模型。在母胎界面的细胞滋养层上高表达的HLA-G能够抑制子宫蜕膜NK细胞的杀伤活性,在保护胎儿不被母体排斥的过程中具有重要的作用。但HLA-G究竟是哪些特定构象或氨基酸同NK细胞上其特异性受体相互作用,目前尚没有明确的结论。我们研究的目的就是通过比较正常和特定氨基酸的突变的HLA-G分子与特异性受体之间的作用力的强弱及功能活性变化来探讨HLA-G与其受体的作用机制。 本研究用基因工程技术将BirA酶底物肽(BSP)的编码基因克隆到MHC分子上,利用其与生物素特异性稳定结合的能力及生物素的多价性,将MHC分子捆绑成四聚体复合物,从而在MHC分子与KIR结合的过程中从而标记和识别NK细胞。本试验研究的目的就是构建和表达该融合蛋白,为HLA-G1与其受体的作用机制研究奠定基础。 研究利用PCR的方法分别扩增了HLA-G1的胞外功能基因和BSP基因,用SOE PCR将它们拼接成融合基因(HB),并将HB克隆至载体pET28a,成功构建成了表达载体pET28a-HB。将其转化BL21(DE3)菌,在最佳的诱导表达条件下,即37℃,在含1mmol/L的IPTG的LB培养基中融合蛋白和hβ 2M分别于诱导5h,3h,两蛋白均以包涵体的形式得到了大量的表达。SDS-PAGE电泳显示其分子量分别为36kD和11kD,与预期相符。在Western blot免疫印迹分析,融合蛋白与87G单克隆抗体,hβ 2M与其腹水多克隆抗体发生特异性反应。由于融合蛋白在大肠杆菌中表达始终形成包涵体,而HLA-G胞外区本身含有两个二硫键,给为蛋白质正确折叠造成很大困难,因此,在对表达产物形成的包涵体溶解、洗涤、复性等一系列过程中,摸索出融合蛋白HLA-G1复性的最适条件,提高其复性率。融合蛋白包涵体经6mol/L的尿素溶解后用Co~(2+)离子树脂纯化,获得理想的纯化效果。hβ 2M蛋白包涵体经洗涤溶解后目的蛋白浓度占全部包涵体蛋白的30%,满足辅助HLA-G1融合蛋白复性的要求。 重组融合蛋白HLA-G1在与hβ 2M稀释法共复性,超滤浓缩后,在10μg/ml的浓度下,分别以NK92和K562细胞为效应细胞和靶细胞,在5:1和2.5:1的效靶比例下,用乳酸脱氢酶法(LDH法)测定NK细胞对K562细胞的杀伤活性。结果表明10μg/ml HLA-G1融合蛋白能显著抑制NK细胞的杀伤活性,加入1.9μg/ml HLA-G1融合蛋白抗体87G能阻断大部分HLA-G1的抑制活性。
【学位授予单位】:中国农业大学
【学位级别】:硕士
【学位授予年份】:2005
【分类号】:Q78

手机知网App
【参考文献】
中国期刊全文数据库 前5条
1 杨红,叶尚勉,徐玉川,胥维勇,李科,陈德忠;HLA-G在生殖系统癌中的检测:免疫组织化学研究[J];中国组织化学与细胞化学杂志;2001年01期
2 郭素娟;HLA-G分子表达调控及其功能研究进展[J];国外医学(免疫学分册);2003年05期
3 温见燕,张玲,王芸,毛海婷,温培娥,崔树龄,李登华,顾洪涛;HLA-G反义寡核苷酸对绒癌细胞免疫逃逸的影响[J];现代免疫学;2004年02期
4 孟海英,侯一平;HLA-G的遗传、功能及临床意义[J];中华医学遗传学杂志;2002年04期
5 鱼艳荣,汪蕴,丰美福;母胎界面MHC-Ⅰ类分子及其与蜕膜淋巴细胞的相互作用[J];自然科学进展;2004年03期
【共引文献】
中国期刊全文数据库 前10条
1 孙肖红;孟维珊;付士红;冯云;翟友刚;王静林;王焕琴;吕新军;梁国栋;;中国首次分离到Kadipiro病毒[J];病毒学报;2009年03期
2 李增曦,杨玉梅;高血压相关基因的研究进展[J];包头医学院学报;2003年02期
3 杨玉梅,李增曦;高血压的基因治疗[J];包头医学院学报;2005年03期
4 连葆强;康德智;苏东辉;;胶质瘤的免疫逃逸研究进展[J];中国神经肿瘤杂志;2003年03期
5 李骢;周情;姜妙娜;张彩华;贾玉杰;;肝复康对大鼠肝组织血小板衍生生长因子表达及对胶原合成的影响[J];实用肝脏病杂志;2012年02期
6 张发明;钱叶本;;肝癌复发与机体的免疫逃逸[J];肝胆外科杂志;2010年02期
7 谢艳爽,郭顺根;血小板衍生生长因子在肝星状细胞内的信号转导[J];中国组织化学与细胞化学杂志;2004年03期
8 张彩,田志刚;肿瘤免疫逃逸机制的研究进展[J];国外医学(肿瘤学分册);2000年02期
9 杨海波,何琳惠,池永斌,王植柔;人类白细胞抗原-G cDNA的克隆及序列分析[J];广西医科大学学报;2005年03期
10 叶晟;妊娠免疫耐受与器官移植[J];国外医学(免疫学分册);2003年01期
中国重要会议论文全文数据库 前1条
1 刘伟;;子痫前期与免疫学[A];第十期“全国女性生殖免疫”学习班暨反复胚胎着床和早期妊娠失败专题研讨会资料汇编[C];2007年
中国博士学位论文全文数据库 前10条
1 魏麟;猪LBP和BPI基因多态性及其蛋白质N端功能研究[D];湖南农业大学;2011年
2 边海勇;新型多靶点抗肿瘤维甲酸类衍生物的设计、合成与生物活性研究[D];山东大学;2011年
3 武文;人肝癌中新基因MAGB-n的克隆及其表达研究[D];第四军医大学;2002年
4 杨欣伟;小鼠肝癌SEA/B7.1免疫基因治疗的实验研究[D];第四军医大学;2002年
5 刘海涛;中药扶正合剂治疗LA795转移性肺癌小鼠的实验研究[D];天津中医学院;2002年
6 刘承利;转4-1BBL基因的小鼠肝癌细胞疫苗抗肿瘤作用的研究[D];中国人民解放军第四军医大学;2003年
7 陆宇;结核分枝杆菌mRNA定量检测作为活菌标志及其用于利福平药物敏感性分析、化疗反应监测的研究[D];北京市结核病胸部肿瘤研究所;2003年
8 叶晟;脂肪变性供肝肝移植的实验研究[D];第三军医大学;2002年
9 王昆;部分中国黄牛BoLA-DQB、DRB_3基因及其上游调控区序列分析[D];中国农业大学;2004年
10 王焕英;小鼠早期胚胎滋养层细胞与恶性肿瘤细胞侵袭性比较研究[D];重庆医科大学;2004年
中国硕士学位论文全文数据库 前10条
1 琚娟;HLA-G基因上游调控区SNP与重度子痫前期的相关性研究[D];郑州大学;2010年
2 童熹;舌鳞癌细胞微环境对小鼠树髓源性树突状细胞生长分化影响[D];重庆医科大学;2011年
3 秦三利;真核重组质粒pEGFP-FcγRIIb的构建及其在BALB/c小鼠体内的表达[D];宁夏医科大学;2011年
4 李蓓蓓;BoLA-NC1在妊娠奶牛和新生牛中的差异表达研究[D];华中农业大学;2011年
5 郭庆东;脑胶质瘤患者抗胶质瘤抗体的检测和筛选[D];第四军医大学;2002年
6 韩玉波;利用荧光原位杂交技术检测RNA聚合酶Ⅲ在CHO细胞核中的转录位点[D];首都师范大学;2003年
7 刘晓琳;稀土纳米材料的抗菌性研究[D];青岛大学;2003年
8 汤海洋;免疫耐受相关分子sHLA-G1的表达、纯化及其活性分析[D];西北农林科技大学;2003年
9 连葆强;高表达HSP70鼠脑胶质瘤瘤苗的体内抗瘤作用研究[D];福建医科大学;2003年
10 尚曦莹;RI基因在人脐血干细胞中的转染和表达[D];大连医科大学;2003年
【二级参考文献】
中国期刊全文数据库 前3条
1 韩子英,王利,马宝骊,张继英,张汉明,柏峻,张莉;HLA-G诱导T细胞免疫耐受的实验研究[J];上海免疫学杂志;2001年05期
2 梁英杰,黎红,赖英荣;免疫组织化学LDP染色法在病理诊断中的应用[J];中华病理学杂志;1999年01期
3 ;Immunoinhibitory effect of soluble HLA-G1 on the cytotoxicity of NK92 cells[J];Progress in Natural Science;2003年03期
【相似文献】
中国期刊全文数据库 前10条
1 韩军艳,黄亚非,吴雄文,龚非力;从妊娠人胎盘绒毛组织克隆HLA-G1 cDNA[J];同济医科大学学报;2001年03期
2 韩军艳,黄亚非,吴雄文,龚非力;表达HLA-G1的K562细胞抵抗外周血NK细胞杀伤作用的研究[J];免疫学杂志;2001年04期
3 周建军,曲宏,吴才宏,韩卫东,李志伟,丰美福;中国人HLA-G1的cDNA克隆、序列分析、表达和蛋白质空间结构预测[J];北京大学学报(自然科学版);2002年02期
4 李许卿;双链DNA片段的碱基空间模式BSP——基因组调控区的一种可能的信息编码方式[J];云南天文台台刊;2002年01期
5 房崇芸,翁秀芳,吴雄文,梁智辉,陈浩,韩军艳,黄亚非,龚非力;可溶性HLA-G1上调活化的同种反应性T细胞表达FasL促进其凋亡[J];中华微生物学和免疫学杂志;2004年12期
6 杨敬宁,陈庆,许景云,邓维秀;HLA-G突变分子对NK细胞抑制作用的研究[J];郧阳医学院学报;2004年06期
7 王业罡;张健民;李允俊;;基于VxWorks的串行通信编程方法[J];延边大学学报(自然科学版);2007年01期
8 王少杰;肖擎刚;王鸿健;;信息化小区宽带以太网接入交换机的设计与实现[J];邵阳学院学报(自然科学版);2006年03期
9 李婷;;基于嵌入式Linux的BSP概念与开发[J];科技信息(科学教研);2007年34期
10 董小曼;田博;杨冰;潘殊男;栗妍;沈淑琴;王晋;;ELISA法检测疫苗中残余牛血清蛋白含量的方法学验证[J];现代仪器;2006年06期
中国重要会议论文全文数据库 前10条
1 陈洪陶;王生原;武继刚;朱智林;杨庆德;;BSP在分布式数据库系统规范中的应用[A];第九届全国数据库学术会议论文集(上)[C];1990年
2 王慰;;VxWorks下的Flash器件自适应TFFS文件系统的实现[A];中国通信学会第六届学术年会论文集(下)[C];2009年
3 周靖;苏绍璟;乔纯捷;;Virtex-4平台下嵌入式系统VxWorks的实现[A];第三届全国嵌入式技术和信息处理联合学术会议论文集[C];2009年
4 臧亚彬;余雪丽;;基于OpenGL的3D矿山救护训练游戏的场景管理[A];AECC专题学术研讨会论文集[C];2007年
5 王慰;胡超;;基于PPC824X系列CPU的自适应Flash系统的设计和实现[A];中国通信学会第六届学术年会论文集(下)[C];2009年
6 邓作;;嵌入式系统非均匀flash空间映射与合并的研究[A];2007通信理论与技术新发展——第十二届全国青年通信学术会议论文集(上册)[C];2007年
7 熊文峰;李亚利;;基于XSCAL PXA255处理器的Win CE 420嵌入式操作系统BSP开发[A];海南省通信学会学术年会论文集(2006)[C];2006年
8 谢诚;虢仲平;;基于PENTIUM处理器的嵌入式BSP技术[A];第二届全国信息与电子工程学术交流会暨第十三届四川省电子学会曙光分会学术年会论文集[C];2006年
9 彭绍林;周治国;刘志文;;VxWorks实时操作系统下网络芯片DM9000驱动的实现[A];全国第一届嵌入式技术联合学术会议论文集[C];2006年
10 王博;宁帆;;基于S3C4510B微处理器的VXWorks BSP的开发与设计[A];第一届中国高校通信类院系学术研讨会论文集[C];2007年
中国重要报纸全文数据库 前10条
1 刘欣一;BSP能崛起吗?[N];人民邮电;2000年
2 ;BSP助火IBM直销走俏高校[N];计算机世界;2001年
3 本报记者 刘焱焱;BSP规范之源[N];网络世界;2001年
4 本报记者 汪云;BSP 可能迷失的征程?[N];计算机世界;2001年
5 本报记者 周蕾;BSP和光新航程的翅膀[N];网络世界;2001年
6 马云飞;从ASP到BSP:并非仅是字母游戏[N];中国计算机报;2000年
7 本报记者 陈宇;永远的分销[N];计算机世界;2001年
8 本报记者 李云杰;资本市场 和光和牌[N];中国计算机报;2001年
9 本报记者 孙爱军;和世纪之光创现代商务[N];中国经营报;2001年
10 ;增进相互交流促进持久合作[N];国际商报;2001年
中国博士学位论文全文数据库 前5条
1 杨宁;HLA-G诱导肝脏移植免疫耐受的研究[D];第二军医大学;2004年
2 宿文辉;人新的精子结合蛋白基因TSBP的真核表达、纯化及功能研究[D];中国医科大学;2007年
3 赵静;绵羊Hoxc8和Hoxd11基因甲基化和突变位点的研究[D];内蒙古农业大学;2011年
4 赵丽霞;克隆绵羊印记相关基因的DNA甲基化研究[D];内蒙古农业大学;2010年
5 吴学琼;骨髓增生异常综合征中甲基化致病相关基因的筛选研究[D];华中科技大学;2010年
中国硕士学位论文全文数据库 前10条
1 张海泉;重组HLA-G1基因的克隆、原核表达、纯化及功能的初步研究[D];中国农业大学;2005年
2 杜玉娟;原发性乳腺癌BSP的表达对早期预测骨转移价值的研究[D];河北医科大学;2012年
3 燕慧;BSP基因沉默对乳腺癌细胞转移性质的影响[D];华南理工大学;2010年
4 谢晋根;BSP矿业有限公司“三步走”发展战略研究[D];湘潭大学;2010年
5 王丽;BSP基因沉默对乳腺癌细胞的粘附、侵袭和骨转移性质的影响[D];华南理工大学;2011年
6 陈明;基于S3C44BOX的嵌入式开发平台设计与实现[D];中南大学;2005年
7 周劲旭;高通量脑胶质瘤组织芯片的制备和靶标GOLPH3、BSP的功能研究[D];第二军医大学;2012年
8 丁晓波;基于嵌入式Linux系统的BSP技术研究[D];电子科技大学;2005年
9 仵伟;基于VxWorks的嵌入式web系统的研究与设计[D];西南交通大学;2006年
10 尹呈良;一种基于ARM7的嵌入式系统网络通信研究与应用[D];山东师范大学;2006年
 快捷付款方式  订购知网充值卡  订购热线  帮助中心
  • 400-819-9993
  • 010-62791813
  • 010-62985026