生姜原生质体培养与体细胞变异

【摘要】：生姜(Zingiber.officinale Rosc.)是姜科、姜属能形成根状茎的一个栽培种。广泛分布于亚洲热带、亚热带地区,在南非、北美和澳大利亚也有栽培,是集调味品、食品加工原料和药用为一体的高效多用途蔬菜。生姜以根状茎作为繁殖材料,繁殖系数低,容易通过种姜传播病害,而且长期无性繁造成种性退化。由于姜很少开花结籽,因此无法通过有性杂交手段进行种质创新和品种改良。本论文以河南鲁山县张良姜、陕西城固黄姜、湖北枣阳生姜、四川竹根姜为试材,建立了生姜胚性愈伤组织诱导和植株再生体系、胚性悬浮系再生体系,获得了原生质体再生植株,分析了离体培养过程中的体细胞变异情况,获得如下结果: 1 以各生姜地方品种的茎尖组织为材料,诱导产生了胚性愈伤组织,建立了高频再生体系。筛选出了适于胚性愈伤诱导及扩增最佳培养基MSN+1.0mg·L~(-1)2,4-D+0.2mg·L~(-1)KT+3.0%蔗糖+0.7%琼脂;胚性愈伤组织分化培养基MS+0.2mg·L~(-1)2,4-D+5.0mg·L~(-1)BA+3.0%蔗糖+0.7%琼脂;根状茎形成培养基MS+3.0mg·L~(-1)BA+0.1mg·L~(-1)NAA+6.0%蔗糖+0.7%琼脂。植物激素、氮源对生姜茎尖胚性愈伤组织形成和再分化有较大影响。蔗糖比葡萄糖更利于根状茎的诱导,活性炭对根状茎诱导没有明显作用。不同品种间胚性愈伤组织诱导、愈伤组织再分化以及植株再生能力存在一定的差异。 2 以胚性愈伤组织为材料,建立了胚性细胞悬浮系,并获得了再生植株。结果表明悬浮细胞干重和pH之间有一定的相关性。接种量和AgNO_3含量对悬浮细胞的生长都有影响:最佳接种量为1.0%,最适AgNO_3浓度为6.0mg·L~(-1)。不同品种间胚性细胞悬浮系的生长能力不同。悬浮系愈伤组织的分化能力低于其对应的胚性愈伤组织分化能力。 3 利用生姜胚性细胞悬浮系成功分离得到原生质体,获得SC姜再生植株。酶种类和浓度、渗透压调节剂种类和浓度对分离原生质体有重要影响,最佳酶液组成为4.0%纤维素酶、1.0%离析酶、0.1%果胶酶、11%甘露醇、0.5%CaCl_2和0.1%MES。原生质体产量达到6027×10~6g~(-1),原生质体活力为90.7%。悬浮培养时间对分离原生质的产量和活力有影响。葡萄糖比蔗糖更利于纯化后原生质体分裂和生长。低浓度的AgNO_3(2.0-6.0mgl~(-1))可以降低原生质愈伤组织褐化速度。不同品种间在原生质体分裂、愈伤组织分化、植株再生方面有显著差异。 4 对各品种生姜的胚性愈伤组织再生植株、胚性悬浮系再生植株、原生质体再生植株进行形态学、细胞学、分子生物学鉴定。结果表明,再生植株外部形态没有明显变异。再生植株的染色体数目没有变异。RAPD多态性分析表明,再生植株存在较广泛的体细胞变异。对各品种胚性愈伤组织、胚性悬浮系愈伤组织、原生质体再生愈伤组织进行细胞学鉴定和RAPD分析表明,愈伤组织的体细胞变异率远远高于再生植株的体细胞变异率。继代次数对体细胞变异率也有影响,随着继代时间的延长,体细胞变异率有上升趋势。