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《中国农业大学》 2005年
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利用体细胞核移植技术生产猪克隆胚胎的研究

张运海  
【摘要】:猪是人异种器官移植理想的器官来源。体细胞核移植为人们生产不引起免疫排斥以及无内源性病毒的猪提供了可能。本研究系统地研究了猪体细胞克隆相关技术环节,旨在搭建一个能有效生产猪克隆胚的平台。主要内容如下: 利用组织块培养法建立了中国实验用小型猪9个40d胎儿成纤维细胞系和1个成体成纤维细胞系。利用血清饥饿以及接触抑制对细胞进行细胞周期同期化处理,发现细胞同期到G0/G1期的效率相同,而且在处理2d之后,G0/G1期细胞比例不再有显著增加。结果表明胎儿成纤维细胞对血清饥饿以及接触抑制的反应相当,同期处理2d即可为核移植提供足够的供体细胞。 比较了不同培养基,氧分压以及添加胰岛素和LIF对猪卵母细胞体外成熟,成熟后孤雌激活发育的影响,首次尝试将一种新的胚胎培养基PZM-3用于猪卵母细胞体外成熟,还探索了猪体外成熟卵母细胞孤雌激活方案。结果如下:NCSU-23中,卵母细胞核成熟明显优于在TCM199中成熟的效果(p0.05);1.4kv,100μs,1DC电激活后,卵母细胞死亡率明显高于2.0kv/cm,30μs,1DC和2.0kv/cm,60μs,1DC处理组。但激活后三组间胚胎卵裂率(分别为:72.6%vs.85.9%,73.2%)和囊胚率(分别为:32.1%vs.49.4%,39.0%)相似;化学激活后,胚胎卵裂以及囊胚率都明显不如电激活处理(卵裂率14.4%vs.72.8%;囊胚率3.3%vs.31.5%);以NCSU-23为基础培养基,高氧核成熟显著优于低氧;以改进的PZM-3成熟卵母细胞,核成熟上仍然是高氧优于低氧。若不考虑气相影响,PZM-3的成熟效果明显不如NCSU-23;添加5μg/ml胰岛素后卵母细胞成熟效果显著提高,但是成熟后激活发育没有显著改善。而添加1000 IU/ml LIF卵母细胞核成熟率不但没有明显提高,反而孤雌激活后囊胚率急剧下降,尽管卵裂率以及囊胚细胞总数都没有明显改变。上述结果表明①NCSU23是猪卵母细胞比较理想的培养基,其成熟卵在2.0kv/cm,30μs,1DC或者2.0kv/cm,60μs,1DC电击参数激活下发育比较好;②高氧对卵母细胞核成熟有利,但附植前孤雌胚胎发育具有培养基依赖性;③添加Insulin可以改善卵母细胞核成熟,而添加LIF对卵细胞质成熟有害;④PZM-3如果应用于卵母细胞体外成熟还需要进一步优化。 比较了IVF,PA以及SCNT胚胎的发育率和囊胚质量。三者发育率相似(囊胚率分别为:11.0%,22.6%和16.9%),但是在囊胚质量即ICM/总细胞数比例上,IVF和SCNT胚优于PA胚。比较了PZM-3和NCSU-23培养对孤雌激活胚以及克隆胚发育的影响。对PA胚来讲,PZM-3明显好于NCSU-23(囊胚率35.4%vs.22.6%,p0.05);而对SCNT胚,PZM-3明显不利于卵裂,但对囊胚发育影响不大(21.1%vs.26.6%,p0.05)。在NCSU-23+4 mg/ml BSA中添加5μg/ml胰岛素对胚胎发育没有明显促进作用,而添加1000 IU/ml LIF也没发现有损害早期发育的情况。上述结果表明,对孤雌胚或者体外受精胚理想的培养基,当用于克隆胚胎培养时却不一定是最佳的选择;孤雌胚胎在体内发育能力差,可能和ICM/总细胞数很低有关。添加5μg/ml Insulin或者1000IU/ml LIF对孤雌激活胚胎早期发育没有显著影响。 利用脂质体转染技术建立了转GFP的猪胎儿成纤维细胞系,尝试了生产转GFP胚胎的可能性,同时系统研究了供体细胞转染与否、传代次数、准备方式、细胞周期同期化、细胞年龄、细胞形态以及细胞性别等对克隆胚胎早期发育的影响。结果如下:用转GFP的细胞获得克隆胚胎
【学位授予单位】:中国农业大学
【学位级别】:博士
【学位授予年份】:2005
【分类号】:Q813

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【引证文献】
中国期刊全文数据库 前10条
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【同被引文献】
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中国硕士学位论文全文数据库 前7条
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【二级引证文献】
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5 张德福;戴建军;吴彩凤;吴华莉;刘东;杨宇;张廷宇;刘伟;殷方芝;王少兵;王昭凯;;猪胚胎玻璃化冷冻保存技术的优化[J];生物工程学报;2009年07期
6 黄波;郇延军;石永乾;王峰;何文腾;张鑫淼;刘仲凤;朱江;吕明;刘忠华;;TSA浓度及处理时间对猪体细胞核移植胚胎体外发育影响[J];东北农业大学学报;2011年03期
7 冯怀亮,秦鹏春,吴光明,谭景和;猪卵母细胞体外成熟和体外受精卵表面元素的研究[J];生物技术;1991年03期
8 岳根华,H Bartenschlager,G Moser,H Geldermann;在猪12号染色体上定位数量性状位点(英文)[J];遗传学报;2000年10期
9 张一飞,黄铁柱,张兴华,余明华,唐杰;人与猪升主动脉一维载荷下的生物力学特性[J];郧阳医学院学报;2004年02期
10 程栋!454150焦作,张苏河,栗夏莲,李凤良,吴清莲!454150焦作,王开杰;微囊化猪胰岛的免疫原性研究[J];中华器官移植杂志;2000年06期
中国重要会议论文全文数据库 前10条
1 魏凤;房慧伶;兰宗宝;卢晟盛;;不同电激活参数对猪体外成熟卵母细胞孤雌胚发育的影响[A];中国畜牧兽医学会动物解剖学及组织胚胎学分会第十四次学术研讨会论文集[C];2006年
2 马红;李忠秋;郭镇华;刘娣;;线菌酮对猪卵母细胞孤雌发育影响的研究[A];中国动物遗传育种研究进展——第十五次全国动物遗传育种学术讨论会论文集[C];2009年
3 庄广伦;;体外受精—胚胎移植与早期妊娠失败[A];第十期“全国女性生殖免疫”学习班暨反复胚胎着床和早期妊娠失败专题研讨会资料汇编[C];2007年
4 钱建共;吴文忠;孙炜;刘怡雯;陈玲;;绵羊胚胎移植技术报告[A];《2008中国羊业进展》论文集[C];2008年
5 许细叶;;接受体外受精-胚胎移植妇女心理压力调查分析及对策[A];全国妇产科护理学术交流暨专题讲座会议论文汇编[C];2008年
6 权富生;赵晓娥;安志兴;李裕强;张志平;李向臣;;农户波尔山羊MOET项目实施研究[A];全国首届动物生物技术学术研讨会论文集[C];2004年
7 邓立新;王国谨;贺丛;田超;杨开红;;布尔山羊胚胎移植及其B超监测的实验研究[A];中国畜牧兽医学会兽医影像技术学分会第九次学术研讨会论文集[C];2004年
8 张文杰;张吉林;;立足综合效益 突出科技创新 推动肉羊胚胎移植产业化发展[A];2005中国羊业进展——第二届中国羊业发展大会会刊[C];2005年
9 叶贵丹;谭晓珊;胡雪梅;陈家;仙子丽;;体外受精胚胎移植术中宫腔积液的病因及处理[A];第二届西部地区(12省区)妇产科学术会议论文汇编[C];2006年
10 李俊杰;桑润滋;金东航;田树军;韩建永;李铁栓;;影响波尔山羊胚胎移植妊娠效果因素研究[A];全国首届动物生物技术学术研讨会论文集[C];2004年
中国重要报纸全文数据库 前10条
1 李伟立;冬季谨防猪瘫痪[N];河南科技报;2004年
2 洪学;猪五种常见病的防治[N];河南科技报;2005年
3 记者 叶斌;这只猪长“人手”?[N];雅安日报;2005年
4 伊世东;定点屠宰:不再半夜猪嚎[N];中国食品质量报;2005年
5 树军;悲鸿画猪[N];人民政协报;2002年
6 王德富 肖勇;岳池外出民工回乡创“猪”业[N];广安日报;2005年
7 王篷;马来西亚宰猪千头遏病毒[N];检察日报;2000年
8 丁立威 丁乡;猪鸡分层联养法[N];新疆科技报(汉);2005年
9 丁立威;猪鸡分层联养效益高[N];云南科技报;2005年
10 丁立威;猪鸡分层联养效益高[N];中国特产报;2005年
中国博士学位论文全文数据库 前10条
1 张运海;利用体细胞核移植技术生产猪克隆胚胎的研究[D];中国农业大学;2005年
2 康锦丹;去乙酰化抑制剂对五指山小型猪体细胞核移植胚胎发育能力的影响[D];延边大学;2012年
3 张德福;猪体细胞核移植及其相关技术研究[D];南京农业大学;2008年
4 马红;猪体细胞核移植及体外受精技术的研究[D];东北农业大学;2010年
5 赵高平;马体细胞核移植的研究[D];内蒙古农业大学;2011年
6 郇延军;表观遗传修饰状态与猪体细胞核移植胚胎发育潜能研究[D];东北农业大学;2012年
7 付博;猪体细胞核移植重构胚构建的影响因素研究[D];东北农业大学;2010年
8 严兴荣;小鼠卵母细胞父系遗传背景对核移植和孤雌胚胎发育的影响[D];西北农林科技大学;2008年
9 邓立新;羊胚胎移植过程中的B超动态监测研究及图谱创建[D];中国农业大学;2005年
10 梁素丽;牛体细胞核移植重编程研究[D];西北农林科技大学;2011年
中国硕士学位论文全文数据库 前10条
1 杨宇;体细胞核移植技术构建猪克隆胚胎的研究[D];四川农业大学;2007年
2 刘珠果;猪卵母细胞孤雌激活、胚胎培养和成熟过程中细胞因子作用的研究[D];中国人民解放军军事医学科学院;2005年
3 魏凤;猪卵母细胞孤雌激活相关研究[D];广西大学;2006年
4 蒋哲文;宁夏银北地区肉羊快速繁育技术示范推广[D];吉林大学;2005年
5 潘登科;山头体细胞核移植(克隆)及胚胎移植的研究[D];甘肃农业大学;2002年
6 陈兵;山羊同期发情、超数排卵及胚胎移植研究[D];西南师范大学;2003年
7 杨正田;核移植制备t-PAm山羊乳腺生物反应器的初步研究[D];中国人民解放军军事医学科学院;2004年
8 孙晓琳;提高奶牛性别鉴定胚胎移植妊娠率的研究[D];河北农业大学;2006年
9 代相鹏;波尔山羊胚胎移植影响因素的研究[D];南京农业大学;2004年
10 张传师;胚胎移植诱导肉牛双胎的研究[D];四川农业大学;2006年
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